Вирусология общая Горячкиной

9 0 Общ ая медицинская вирусология

Первичное заражение лабораторных ж ивотных вирус­ содержащ им материалом не всегда приводит к развитию экспериментальной инфекции. При многих вирусных ин­ фекциях возмож ны так называемые «слепые» пассажи, при которы х наличие вируса выявить не удается.

После 4 -5 таких пассажей через организм восприим ­ чивого ж ивотного вирус приобретает способность вы зы ­ вать заболевание. При этом в соответствую щ их тканях вирус накапливается в достаточном количестве, что по­ зволяет провести его идентификацию.

На лабораторных ж ивотных проводят титрование ви­ русов, ставят реакцию нейтрализации; ж ивотных исполь­ зуют для получения вирусных вакцин, диагностикумов, противовирусны х сы вороток.

3.4. Методы индикации и идентификации вирусов в клеточных культурах

Однослойные культуры клеток имеют первостепенное значение в диагностике большинства вирусных инфекций. С помощ ью клеточных культур удается обнаружить (ин ­ дикация) и выделить вирус из исследуемого материала, поддерживать вирус в лабораторных условиях и провести идентификацию вируса. Используя культуры клеток, вы ­ являют противовирусные антитела в испытуемых сы во­ ротках.

Для выделения и культивирования вирусов пригодны высоковосприимчивые (чувствительные) культуры клеток, в которы х вирусы способны размножаться (репродуциро­ ваться) в бесконечном ряде пассажей. Такими вы сокочув­ ствительными культурами чаще всего являются культу­ ры клеток человеческого происхож дения (первичные, пе­ ревиваемые, диплоидные), а такж е культуры клеток из почек обезьян. Нередко используют клеточные культуры, получаемые из тканей ж ивотных и птиц. В настоящее время подобраны высокочувствительные культуры кле­ ток к подавляющ ему больш инству известных вирусов.

90 Общ ая медицинская вирусология

Первичное заражение лабораторных ж ивотных вирус­ содержащ им материалом не всегда приводит к развитию экспериментальной инфекции. При многих вирусных ин­ фекциях возмож ны так называемые «слепые» пассажи, при которы х наличие вируса выявить не удается.

После 4 -5 таких пассажей через организм восприим ­ чивого ж ивотного вирус приобретает способность вы зы ­ вать заболевание. При этом в соответствую щ их тканях вирус накапливается в достаточном количестве, что по­ зволяет провести его идентификацию.

На лабораторных ж ивотны х проводят титрование ви­ русов, ставят реакцию нейтрализации; ж ивотных исполь­ зуют для получения вирусных вакцин, диагностикумов, противовирусных сы вороток.

3.4. Методы индикации и идентификации вирусов в клеточных культурах

Однослойные культуры клеток имеют первостепенное значение в диагностике большинства вирусных инфекций. С помощ ью клеточных культур удается обнаружить (ин ­ дикация) и выделить вирус из исследуемого материала, поддерживать вирус в лабораторных условиях и провести идентификацию вируса. Используя культуры клеток, вы ­ являют противовирусные антитела в испытуемых сы во­ ротках.

Для выделения и культивирования вирусов пригодны высоковосприимчивые (чувствительные) культуры клеток, в которы х вирусы способны размножаться (репродуциро­ ваться) в бесконечном ряде пассажей. Такими вы сокочув­ ствительными культурами чаще всего являются культу­ ры клеток человеческого происхож дения (первичные, пе­ ревиваемые, диплоидные), а такж е культуры клеток из почек обезьян. Нередко используют клеточные культуры, получаемые из тканей ж ивотных и птиц. В настоящее время подобраны высокочувствительные культуры кле­ ток к подавляющ ему больш инству известных вирусов.

Определенные клеточные культуры обладают избиратель­ ной чувствительностью к тому или иному вирусу. Так, например, на почечных клетках обезьян хорош о размно­ ж аю тся полиовирусы, на перевиваемой культуре клеток HeLa — вирусы гриппа А и В, на первичной культуре фибробластов куриного эмбриона — герпесвирусы и поксвирусы и т.п. Таким образом, чувствительность к виру­ сам определяется как свойствами клеток, так и природой вируса. Для успешной репродукции вирусов большое зна­ чение имеют: состав питательной среды, в которой куль­ тивирую тся клетки, значение pH, присутствие сы ворот­ ки, температура инкубации, возраст, ж изнеспособность и плотность клеточной популяции, множественность вирус­ ной инфекции, синтез интерферона и другие факторы. Н а­ пример, парагриппозные вирусы не репродуцируются в клеточной культуре, если в питательной среде присутству­ ет сы воротка; риновирусы размножаются в культуре кле­ ток при температуре 33 С, обязательно во вращ ающ ихся пробирках.

Учет всех этих данных мож ет оказать определенную помощь в диагностике, позволяет проводить предваритель­ ную (ориентировочную) идентификацию выделяемого ви ­ руса.

И ндикация. При заражении вирусами клеточных куль­ тур мож но получать различные видимые проявления дей­ ствия вируса:

1.Ц ит опат ическое дейст вие вируса на культ уру клет ок ( Ц П Д ) , то есть возникновение в ней ви ­ димы х морфологических дегенеративных измене­ ний (литическая инфекция).

2.Приобретение зараженной культурой клеток сп о­ собности к гем адсорбции, т.е. к адсорбции эритро­ цитов на поверхности клеточного слоя.

3.Образование в зараженной клеточной культуре под плотным слоем специального агарового покрытия характерных бляш ек, являю щ ихся «негативными колониями» вирусов.

4.Подавление процессов метаболизма в зараженной вирусом культуре клеток, выявляемое с помощ ью так называемой цвет ной пробы (цветной реакции).

Эти проявления действия вирусов в клеточных куль­ турах и являются основными критериями, с помощ ью которы х проводят индикацию вируса, то есть выявляют его наличие, а такж е устанавливают количественное со ­ держание вируса, определяя его т ит р.

У различных вирусов преобладают те или иные прояв­ ления действия их на клеточные культуры , что использу­ ют для предварительной идентификации вируса.

И дент иф икация. Окончательная идентификация вы ­ деленного вируса проводится с помощ ью реакции нейт ­ рализации с диагност ическим и вируснейт рализую щ и - ми сы ворот к ам и . После предварительного контакта ви ­ руса с сы вороткой этой смесью заражают культуру клеток и судят о наступивш ей нейтрализации, указывающ ей на соответствие вируса и сы воротки, по тем же критериям. Вирус, нейтрализованный специфической сывороткой:

1.Не оказывает цитопатического действия — проис­ ходит реакция нейтрализации (тормож ения) цито­ патического действия.

2.Не вызывает реакции гемадсорбции — наступает реакция задержки гемадсорбции.

3.Не дает образования бляш ек (или значительно уменьш ается их количество) — происходит реак­ ция нейтрализации образования бляшек.

4.Не вызывает подавления метаболизма клеток, что выявляется в реакции нейтрализации по цветной

пробе.

Таким путем проводят серологическую идентификацию вирусов, определяют их родовую и типовую принадлеж ­ ность.

В ы явление ант ит ел. По такому же принципу ставят реакцию нейтрализации для определения неизвестных антител в сы воротке больного. В этом случае исследуе­ мую сы воротку соединяют с известным вирусом, а затем выш еуказанными методами определяют — произошла ли

реакция нейтрализации. Положительная реакция указы ­ вает на то, что антитела сы воротки соответствую т взято­ му в опы т известному вирусу.

Цитопатическое действие (ЦПД) вируса в культуре клеток

Под цитопатическим действием понимают совокупность морфологических и функциональных (в том числе би охи ­ мических) изменений в клетках, возникаю щ их под влия­ нием внедривш егося вируса.

Реакция клеток на заражение вирусом мож ет прояв­ ляться в виде острой вирусной инфекции, латентной ин­ фекции, трансформации клеток. Более выражена реак­ ция клеток при острой вирусной инфекции. Предполага­ ется, что основной причиной ЦПД является нарушение метаболизма клетки. Прекращается синтез РНК клеткихозяина, что ведет к подавлению синтеза белков, приво­ дит к наруш ению структуры клеточны х мембран, лизосом, митохондрий. Освобож даются и активирую тся кле­ точные ферменты (лизосомальные), которы е и вызывают деструкцию клеточных компонентов, т.е. развитие ЦПД.

При резкой дегенерации клеточны й монослой гибнет: клетки отслаиваются от стекла и свободно плавают в куль­ туральной ж идкости в виде бесструктурны х зерен, лизируются.

Ц итопатическое действие вируса на монослой клеток учитывают по четы рехкрестовой системе: «+ + + + » — пол­ ный лизис клеточной культуры; «+ + + » — клеточный слой отсутствует, но имеются единичные клетки, не пораж ен­ ные вирусом; «++>> — дегенеративные изменения наблю­ даются у 50% клеточной культуры ; « + » — дегенератив­ ным изменениям подверглись отдельные клетки монослоя, главным образом в краевых участках.

С и м п л аст ообразован и е. При острой вирусной инфек­ ции мож ет наблюдаться и несколько иной тип цитопатического действия — образование гигантских многоядер­ ных клеток — симпластов (или синцитиев).

9 4 Общ ая медицинская вирусология

Симпластообразование вызывают более 20 различных вирусов, имею щ их ферменты: лецитиназу, нейраминидазу, и богатых липидами (главным образом — парамиксовирусы). Ферменты воздействуют на оболочки клеток од­ нослойной культуры , что приводит к слиянию клеток в громадные многоядерные синцитии.

Включения. К проявлению цитопатического действия вирусов относится образование внутриклеточных вклю ­ чений. Они образую тся, если вирус не вызывает гибели клеток, или на стадиях до наступления гибели. Образова­ ние включений мож ет быть единственным проявлением реакции клетки на внедрение вируса.

Латентная вирусная инфекция клеточной культуры характеризуется репродукцией вируса при отсутствии выраженного цитопатического действия.

Трансформация клеток наступает при заражении кле­ точной культуры онкогенными вирусами, под действием которы х клетки начинают безудержно делиться и распо­ лагаются не монослоем, а растут беспорядочно в несколь­ ко слоев. При заражении такой культурой ж ивотного у него мож ет возникнуть злокачественная опухоль.

Индикация вируса по его цитопатическому дей­ ствию. С целью обнаружения вируса в материалах от боль­ ных проводят заражение исследуемым материалом одно­ слойных культур клеток. Для заражения отбирают про­ бирки со сплош ным клеточным слоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Перед заражением из пробирок отсасы вают культуральную ж идкость, затем вносят по 0,1 мл исследуемого материала и добавляют пи­ тательную среду (поддерж ивающ ую, без сы воротки) до 1 мл. Каж дую пробу материала вносят в 4 пробирки. Для контроля несколько пробирок оставляют незараженными, но также сменяют в них питательную среду. Пробирки выдерживают в термостате, обычно при 37 'С, и ежеднев­ но микроскопирую т с целью обнаружения ЦПД (в тече­ ние недели и более).

Дегенеративные изменения клеточного слоя не менее чем на два креста («+ + »), при отсутствии таковых в неза-

раженной культуре, указывают на наличие в исследуе­ мом материале вируса.

Ц итопатическое действие различных вирусов на кле­ точные культуры (даже если брать различные типы куль­ тур) обладает определенной специфичностью . Родствен­ ные вирусы обычно дают цитопатическую реакцию сход ­ ного типа, эффект действия отдаленных по свойствам вирусов часто различен, поэтому по типу ЦПД нередко можно судить о семействе или роде, к которым относится исследуемый вирус.

Так, для энтеровирусов (вирусы полиомиелита, К окса­ ки, ECHO) характерно ЦПД в виде однородной мелкозер­ нистой деструкции клеток, клетки приобретают округлен­ ную форму, располагаются довольно равномерно. Для ЦПД аденовирусов типичным является превращение клеточного слоя в скопления мелких, округлы х клеток, располож ен­ ных в виде гроздьев винограда. Парагриппозные вирусы , респираторно-синцитиальный, вирусы кори и паротита дают цитопатический эффект в виде образования симпластов. И мею тся и другие не столь характерные проявле­ ния цитопатического действия вирусов.

Титрование вирусов по цитопатическому действию.

Количественное определение вирусов в исследуемом ма­ териале проводится с помощ ью титрования. Для этой цели готовят 10-кратные последовательные разведения вируса, которы ми заражают клеточные культуры (берут по 4 про­ бирки на каждое разведение). В остальном методика тит­ рования вируса по ЦПД не отличается от выш еприведен­ ной методики обнаружения вируса по ЦПД.

Титром вируса называют его наибольшее разведение, вы зываю щ ее ЦПД в половине зараж енных культур (т.е. в 2 пробирках из 4 с данным разведением вируса). Титр вируса вычисляется по методу Рида и Менча. Титр вируса выражают в цитопатических дозах (ЦПД.ц) в 1 мл. За одну ЦП Д .0 принимают 0,1 мл вируссодерж ащ его материала, разведенного до титра.

Идентификация выделенного вируса по нейтрализа­ ции Ц ПД . Вируссодержащ им материалом, подлежащим

идентификации, обычно служит культуральная жидкость из пробирок с клеточной культурой, давших ЦПД при заражении исследуемым материалом.

Для постановки опыта культуральную жидкость (с оп­ ределенной дозой ЦПД50 вируса) смешивают с равным объе­ мом диагностической иммунной сыворотки (берут разведе­ ние сыворотки 1:5 или 1:10). После 1-2-часового контакта при комнатной температуре этой смесью (по 0,2 мл) зара­ жают 4 пробирки с культурой клеток, из которой предва­ рительно была удалена питательная среда; после добавле­ ния смеси в пробирки вносят по 0,8 мл свежей среды. Обыч­ но пробы культуральной жидкости проверяют одновременно с несколькими типовыми сыворотками. Опыт сопровожда­ ется несколькими контролями:

1)контроль незараженной культуры ;

2)контроль дозы вируса — клеточные культуры зара­ ж ают той же дозой вируса, что и в опыте;

3)контроль культуры, зараженной смесью культураль­ ной ж идкости с нормальной сы вороткой.

Опыт учиты вают через 5 -7 дней и более, просматривая пробирки под малым увеличением микроскопа. В первом контроле ЦПД должно отсутствовать, во втором и тре­ тьем — обязательное проявление ЦПД. Отсутствие цито­ патического эффекта в опытных пробирках указывает, что в данной пробе произошла нейтрализация вируса иммун­ ной сы вороткой, т.е. сыворотка соответствует типу выде­ ленного вируса.

Сходным образом проводят т ит рование вируснейт - рализую щ их антител в сыворотке больного. Готовят дву­ кратные последовательные разведения исследуемой сы во­ ротки и смеш ивают каждое из них со стандартной дозой известного вируса (100, 1000 Ц П Д .0), после 1-2-часового контакта смесью заражают клеточные культуры.

Тит ром сы ворот ки называется то наибольшее разве­ дение, которое полностью подавляет ЦПД вируса в поло­ вине взяты х в опыт культур (т.е. в 2 пробирках из 4, на которы х проверяют каждое разведение сыворотки).

Реакция гемадсорбции

Гемадсорбцией называется способность культур клеток, зараженных некоторыми вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты .

Впервые это явление было обнаружено в культуре кле­ ток, зараженных вирусом гриппа. П озже было установле­ но, что гемадсорбирующие свойства имеют многие вирусы (например, орто- и парамиксовирусы, флавивирусы, поксвирусы), эти же вирусы обладают способностью вызывать гемагглютинацию — склеивание эритроцитов. Гемадсорбция и гемагглютинация имеют сходный механизм (см. данную главу). Приобретение способности к гемадсорбции связано со встраиванием в мембрану зараженных вирусом клеток (в участках будущего «почкования» вирусов) вирусспецифических белков — гемагглютининов, к которым эритро­ циты имеют комплементарные рецепторы и поэтому ад­ сорбируются на поверхности зараженных клеток.

В реакции применяют эритроциты морской свинки, кур, обезьян, человека О (I) группы.

Наиболее активными в реакции гемадсорбции являю т­ ся эритроциты , чувствительные к гемагглютинирующ ему действию данного вируса.

Обнаружение вируса в реакции гемадсорбции. Зара­ женные вирусом клетки приобретают способность к ге­ мадсорбции задолго до возникновения в них цитопатических изменений, что позволяет использовать реакцию гемадсорбции для раннего обнаруж ения вирусов в зара­ женной культуре.

По наличию явления гемадсорбции обнаруживают при­ сутствие вирусов в культурах клеток при латентной ин­ фекции, когда цитопатический эффект оказывается сла­ бо выраженным или отсутствует соверш енно. Латентную инфекцию культур клеток могут вызывать аденовирусы, парагриппозные, вирус герпеса и др.

Техника постановки реакции гемадсорбции. П р едва­ рительно кл еточны е кул ьтуры зараж аю т исследуем ы м м а­ териалом по описанной вы ш е м етод и к е. Р еакц и ю гемад-

бирку с зараженной культурой (иногда предварительно удалив среду) вносят по 0,2 мл взвеси эритроцитов (0 ,4 - 1% ) и выдерживают пробирки в наклонном полож ении, чтобы эритроциты соприкасались с клеточным слоем.

Температура, при которой ставят опыт, и экспозиция зависят от вида вируса. При постановке реакции с поксвирусами, вирусами клещ евого энцефалита, опыт п ро­ водят в течение 1 5 -30 минут при комнатной температу­ ре. При проведении реакции с орто- и парамиксовирусами достаточной является экспозиция в 3 -5 минут.

Далее пробирки слегка встряхиваю т и оставляют на некоторое время в вертикальном положении для оседа­ ния неадсорбировавш ихся эритроцитов. При м и кроско­ пии под малым увеличением в опытной пробирке регист­ рируют положительную реакцию гемадсорбции, вы раж а­ ю щ ую ся в том, что эритроциты адсорбируются на клетках культуры , прилипая к клеточному слою; в контрольной пробирке клеточный слой свободен от эритроцитов.

При положительной гемадсорбции скопления эритро­ цитов на клетках могут быть весьма характерными. В и­ рус гриппа дает гемадсорбцию островкового типа; парагриппозные вирусы — диффузного; для поксвирусов ха ­ рактерным является расположение эритроцитов вокруг клеток в виде венчика или ожерелья.

Реакция гемадсорбции наиболее часто применяется для раннего обнаружения парагриппозных вирусов в носогло­ точны х смывах больных. Реакцию применяют такж е и для титрования вирусов и выявления специфических ан­ тител.

Идентификация вирусов в реакции задержки гемад­ сорбции. Было обнаружено, что при добавлении специфи­ ческой иммунной сыворотки в пробирку с клеточной куль­ турой, предварительно зараженной соответствующим виру­ сом, зараженные клетки теряют способность адсорбировать эритроциты, т.е. происходит явление задержки гемадсор­ бции. Вследствие специфичности этого явления реакция