Вирусология общая Горячкиной

4.Через сделанное отверстие виден внутренний лис­ ток скорлупной оболочки, его осторож но надрыва­ ют глазным пинцетом или иглой и отслаивают на небольш ом участке (0 ,5 -1 см 2), обнажив хорионал­ лантоисную оболочку.

5.Производят заражение хорионаллантоисной оболоч­ ки путем нанесения на нее 0 ,1 -0 ,2 мл вируссодер­ жащ его материала (например, вируса осповакцины)

с помощ ью пастеровской пипетки или шприца.

6.О кош ко в скорлупе закрывают специальной элас­ тичной пленкой, стерильным покровным стеклом или стеклянным колпачком . Для прикрепления стекла и колпачка к скорлупе пользуются расплав­

ленным парафином.

Зараженные эмбрионы помещ ают в термостат в верти­ кальном полож ении и инкубируют в течение 2 -3 суток, после чего производят вскрытие по следующим правилам:

1. Яйцо помещ ают на подставку так, чтобы воздуш ­ ное пространство было наверху, проводится стери­ лизация места предстоящ его вскрытия путем соот­ ветствующ ей обработки спиртом и йодом.

2.Удалив пленку, покровное стекло или колпачок, стерильными ножницами срезают скорлупу по гра­ нице воздуш ного пространства.

3.Пользуясь пинцетом, снимают скорлупную оболоч­ ку. Обнаженную хорионаллантоисную оболочку (на которой могут быть видимые изменения) подреза­ ют вдоль края скорлупы . Через образовавшееся от­ верстие выливают все содерж имое яйца в чаш ку или лоток.

4.Оставшуюся внутри скорлупы хорионаллантоисную оболочку осторож но извлекают пинцетом и поме­ щают в стерильную чаш ку с физиологическим ра­

калывают пастеровской пипеткой в том месте, где нет сосудов, и насасывают аллантоисную ж идкость (ее удается набрать 5 -6 мл).

4.Аллантоисную ж идкость переносят в стерильную пробирку, а часть засевают в бульон для проверки на бактериологическую стерильность.

Метод заражения в аллантоисную полость часто при­ меняют для культивирования вируса гриппа, а также па­ ротита и осповакцины .

Зараж ение в полост ь ам ниона. Этот метод более тру­ ден для выполнения и применяется несколько реже пре­ дыдущ их. Особенностью его является то, что при зараже­ нии некоторыми пневмотропными вирусами (например, вирусами гриппа, паротита), последние размножаются не только в клетках оболочки амниона, но и в дыхательных путях и легочной ткани эмбриона, куда проникает инфи­ цированная ж идкость. Для заражения используют эм б­ рионы 7-12-дневного возраста. Заражение в амниотичес­ кую полость проводят откры ты м методом, когда для вве­ дения м атериала в ск орл уп е делается сравнительно большое отверстие, или же закрытым методом, когда за­ ражение производят через прокол скорлупы . Первый из них более травматичен, второй — менее надежен, так как, действуя вслепую, не всегда удается ввести иглу в полость амниона.

Техника откры того метода заражения:

1.Яйцо помещ ают на подставку и проводят стерили­ зацию скорлупы в области тупого конца.

2.Над центром воздуш ного пространства в скорлупе ножницами вырезают окош ко величиной 2 см в по­ перечнике (как для заражения на хорионалланто­ исную оболочку).

3.Осторож но снимают внутренний листок скорлуп­

ной оболочки с помощ ью пинцета, обнажая подле­

ж ащ ую хорионаллантоисную оболочку.

4.П рорезают ножницами небольшое отверстие в х о ­ рионаллантоисной оболочке в том месте, где нет кровеносных сосудов, и вводят в прорез глазной

84 Общ ая медицинская вирусология

Заражение в амниотическую полость является наибо­ лее чувствительным диагностическим методом при выде­ лении вируса гриппа.

Зараж ение в ж елт очный м еш ок. Этот метод находит в вирусологии ограниченное применение и чаще исполь­ зуется для культивирования риккетсий и хламидий, при этом накопление возбудителей происходит в стенке ж ел­ точного меш ка. Для заражения берут 5-7-дневны е эмбри­ оны. Метод заражения в желточный меш ок напоминает по своей технике заражение в аллантоисную полость, толь­ ко игла ш прица вводится немного глубже.

В ж елточный меш ок вводят 0 ,2 -0 ,5 мл инфекционно­ го материала, после чего прокол в скорлупе заливают па­ рафином.

Зараженные эмбрионы выдерж ивают в термостате от 3 до 10 суток, что зависит от вида инфекционного агента. Вскрыв эмбрион, извлекают ж елточный меш ок и подвер­ гают его дальнейшему исследованию.

Заражение в желточный меш ок применяют при куль­ тивировании вирусов лошадиного энцефалита и некото­ рых других.

Кроме описанных выше сущ ествует и другие методы заражения, используемые значительно реже. Например, иногда зараж аю т непосредственно эмбрион, применяя внутримозговой или внутримыш ечный способ введения материала.

3 .3 .2 . Выделение и культивирование вирусов путем заражения лабораторных животных

Методы заражения лабораторных ж ивотных с целью выделения и культивирования вирусов применяются зна­ чительно реже, чем культуры клеток и куриные эмбрио­ ны. Тем не менее для ряда вирусных инфекций выявле­ ние возбудителя путем заражения ж ивотных имеет пер­ востепенное значение (наприм ер, вы явление вирусов К оксаки, беш енства, клещевого энцефалита). Следует от ­ метить, что метод выделения вирусов путем заражения

лабораторных животных был первым и долгое время един­ ственным методом, с помощ ью которого удалось обнару­ жить целый ряд вирусов.

Э ксперим ент альны е м одели . Восприимчивые к изу­ чаемым вирусам животные называются эксперименталь­ ной моделью. В качестве модели отбирают ж ивотны х, об­ ладающих видовой чувствительностью и высокой воспри­

имчивостью к определенным вирусам.

Взятые в опыт животные долж ны быть одного вида, определенного возраста и содерж аться в одинаковых ус­ ловиях.

Возраст экспериментального ж ивотного сущ ественно влияет на воспроизведение инфекции. Например, при за­ ражении вирусами Коксаки использую т мы ш ей-сосунков семидневного возраста, которы е более восприимчивы к этим инфекциям нежели 3-4-недельны е мыши.

Н еобходимым условием успеш ного выделения вирусов является использование ж ивотны х, свободных от латент­ ных (скры ты х) инфекций вирусной, бактериальной или протозойной этиологии, которые нередко встречаются у многих видов лабораторных ж ивотны х. К таким заболе­ ваниям относятся вирусные пневмонии, вирусный энце­ фаломиелит белых мышей, протозойны й энцефалит мно­ гих млекопитающ их и птиц и др.

Для вирусологической работы чащ е всего используют так называемые «чисты е линии» экспериментальны х

86 Общ ая медицинская вирусология

ж ивотных. Они обладают однотипной наследственностью, имеют минимальное число латентных инфекций, облада­ ют высокой восприимчивостью к вирусам. Особенно чув­ ствительны к вирусам ж ивотны е-гнотобионты . Работу с животными рекомендуется проводить в настольном боксе или в специальной операционной вивария. Все отходы и трупы погибш их ж ивотны х автоклавирую т и сж игаю т (см. график 5, стр. 87).

М ет оды и т ехника зараж ения ж ивот ных. Лаборатор­ ных животных заражают различными вируссодержащими материалами, взятыми от больных людей, от павших и забитых ж ивотных и т.п. Исследуемый материал должен быть взят с учетом патогенеза данного вирусного заболева­ ния и тропизма возбудителя. Характеристика вируссодер­ жащих материалов, подготовка и обработка их для виру­ сологических исследований рассмотрены в данной главе.

Способы заражения лабораторных животных, применяе­ мые при вирусологических исследованиях в основном та­ кие же, как при заражении другими инфекционными мате­ риалами. Применяют подкожное, накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, пероральное, интраназальное, интрацеребральное заражение и др. Выбор способа заражения ж ивотных проводят с учетом тропизма исследуемого вируса к определенным тканям.

Ниже приводятся два метода заражения — интрана­ зальное (в нос) и интрацеребральное (в мозг), которые имеют некоторые особенности.

И нт раназальное зараж ение. Этот метод используют для выделения пневмотропных (респираторных) вирусов. Заражение мышей проводится под эфирным наркозом. Ж и­ вотных помещ ают под стеклянный колпак или в закры ­ тую стеклянную банку, в которую положен кусок ваты, пропитанный эфиром. Эфир следует давать в значитель­ ной дозе в течение сравнительно короткого срока для со ­ здания непродолжительного, но глубокого сна. П оказате­ лем достаточности наркоза является глубокое, ритмичное дыхание ж ивотного, отсутствие кашлевых толчков во вре­ мя заражения.

его вводят с помощ ью шприца или пастеровской пипетки в ноздри ж ивотного.

Интраназальный метод заражения ж ивотных можно осущ ествить такж е путем аэрозольного способа введения материала. Для этого подопытное животное помещ ают в специальную камеру, в которой распыляют исследуемый вируссодерж ащ ий материал. За зараженными ж ивотны ­ ми устанавливается наблюдение, при появлении призна­ ков заболевания мышей забивают при помощ и эфирного наркоза, а затем вскрывают.

Этапы вскры т ия ж ивот ных. Для выделения респи­ раторных вирусов вскрытие проводят в следующем по­ рядке:

1.Увлажненный 5% -ны м раствором лизола или фе­ нола труп мыши фиксируют на простерилизованной поверхности (обычно это кювета со смесью воска

ипарафина) брюш ком вверх.

2.Обрабатывают кожные покровы спиртом, йодом и вновь спиртом; опаливают пламенем.

3.Н ожницами делают продольный разрез кожи от нижней челюсти до лобка и боковые разрезы к лап­ кам, отсепаровывают ее.

4.Вскрывают грудную полость, вырезав грудину нож ­ ницами по реберным хрящ ам.

5.Осматривают внешний вид органов грудной полос­ ти, обращая внимание на наличие эксудата. Из­ влекают легкие при строгом соблюдении асептики

исохраняю т их при минусовой температуре в м о­ розильнике до получения ответа на бактериологи­ ческий контроль-результат посева кусочка легоч­ ной ткани в мясо-пептонный бульон (после выдер­ живания его в термостате при 37 С в течение суток).

6.При отрицательном контроле на бактериальную заг­ рязненность готовят 10% -н ую суспензию легочной ткани путем растирания ткани в фарфоровой ступ ­ ке, с постепенным добавлением физиологического раствора.

7.Суспензию центрифугируют для осаждения круп ­ ных частиц при 1500 об/м и н , надосадочную ж ид ­ кость собирают и использую т для последующ его вирусологического исследования.

Инт рацеребральное зараж ение. Этот метод предназ­ начен для выделения нейротропных вирусов.

При заражении мыши в мозг ее плотно прижимают левой рукой к столу, большим и указательным пальцами оттягиваю т кож у головы к заты лку, мизинцем и безы ­ мянным фиксируют хвост. Лобный участок головы пред­ варительно обрабатывают 3% -ной йодной настойкой. За­ раж ающ ий материал (кровь) в объеме 0 ,0 2 -0 ,0 3 мл вво­ дят в м озг туберкулиновым ш прицем с тонкой иглой, снабженной предохранительной муфтой, путем прокола лобной кости на глубину 1 ,5 -2 мм. Материал вводят по­ степенно, чтобы не было резкого повыш ения внутреннего давления.

Эт апы вскры т ия ж ивот ных. Для выделения нейро­ тропных вирусов вскрытие ж ивотны х осущ ествляют в сле­ дующ ей последовательности:

1.Труп увлажняют раствором лизола или фенола.

2.Обрабатывают кожные покровы головы последова­ тельно спиртом, йодом и вновь спиртом, опалива­ ю т пламенем.

3.Вскрывают и отделяют кож у головы . Отрезают го ­ лову, помещ ают ее в стерильную чаш ку Петри, проведя предварительно через пламя горелки.

4.Вскрывают ножницами черепную коробку, извле­ каю т мозг и сохраняют его в замороженном состо­ янии до получения результата бактериологическо­ го контроля.

5.В случае отрицательного бактериологического кон ­ троля из мозговой ткани приготавливают 10% -ную суспензию в физиологическом растворе. О свобож ­ дают ее от крупных тканевых частиц центрифуги­ рованием, надосадочную ж идкость используют для вирусологической работы.