Вирусология общая Горячкиной

идентификации выделенных вирусов, а также с целью обнаружения и титрования вируснейтрализующ их анти­ тел в сы воротках больных.

Метод бляш ек

Бляшками называются округлые участки разрушенных по действием вируса клеток однослойной культуры . Это своеобразные «негативные колонии» вирусов, образовав­ шиеся на месте попадания одного вириона.

Для получения бляшек клеточный монослой заража­ ют небольш ой концентрацией вируса и фиксируют адсор­ бировавш иеся на клетках вирионы с помощ ью агарового покры тия, в которое добавлен витальный краситель — нейтральный красный. В таких условиях ЦПД вирусов имеет очаговый характер, погибш ие клетки дегенериру­ ют, теряю т способность удерживать нейтральный крас­ ный и обесцвечиваются. В результате на непрозрачном равномерно розовом фоне клеточного монослоя появля­ ются бляш ки в виде более прозрачны х неокраш енных округлых пятен.

Одним из первых были получены бляш ки вирусов по­ лиомиелита в однослойной культуре клеток, выращ ивае­

туру клеток в обычном термостате в плоских флаконахматрацах, закрытых резиновыми пробками, иногда в чаш ­ ках Петри, герметизированных лейкопластырем.

П окровная среда. Агаровое покрытие готовят из вы со­ кокачественного агара в концентрации 1 -1 ,5 % и других компонентов — солевых буферных растворов, дополнитель­ ных питательных веществ, антибиотиков. Раствор нейт­ рального красного входит в состав среды или его добавля­ ют во флакон или чаш ку незадолго до учета опыта. Суще­ ствуют различные рецепты покровных сред, применяемые с учетом типа клеточной культуры и вируса.

кровные среды, в которых вместо агара используют гель бентионита (5 -6 % ). Это алюмосиликат природного про­ исхож дения, который биологически инертен и не токси ­ чен для культур клеток. Под бентионитовым питатель­ ным покрытием бляшки хорош о выявляются.

Обнаруж ение и т ит рование вирусов м ет одом бл я ­ шек. Для получения бляшек вирусов во флаконы или чаш ­ ки наливают взвесь клеток в питательной среде (№ 199 или среда с гидролизатом лактальбумина). Флаконы зак­ рывают резиновыми пробками, чаш ки заклеивают лей­ копластырем и помещ ают в термостат на 5 -6 дней для получения монослоя клеток, который должен быть сплош ­ ным, без признаков дегенерации. Перед заражением среду из флаконов или чашек удаляют и однослойную культуру клеток осторож но отмывают раствором Хенкса, которы й затем тщательно отсасывают. Заражение производят путем внесения разведенного исследуемого материала в объеме 0 ,1 -0 ,2 5 мл и равномерного распределения этого матери­ ала по поверхности клеточного слоя с помощ ью покачи­ вания. Через 3 0 -6 0 минут зараженную культуру клеток заливают покровной средой. Флаконы или чашки с за­ стывш ей средой помещ ают в термостат (клеточным слоем кверху) и выдерживают до образования бляшек (2 -5 су ­ ток), после чего производят их подсчет и изучение.

Существует пропорциональная зависимость между раз­ ведением вируссодержащ его материала и количеством об­ разовавш ихся бляш ек, позволяющ ая считать, что каж ­ дая бляш ка образуется в результате размножения в клет­ ках одного вириона.

Способность к образованию бляш ек в настоящее время обнаружена у многих вирусов: полиомиелита, К оксаки, ECHO, энцефалита, гриппа, кори и ряда других.

При изучении морфологии бляшек установлено, что разные вирусы , как правило, образуют бляш ки, отличаю ­ щиеся по величине, форме, характеру краев, по срокам появления и другим свойствам, что может быть использо­ вано для предварительной идентификации вируса.

Наиболее часто метод бляш ек применяют для титро­ вания вирусов. Для этой цели приготовляю т серийные разведения вируссодержащ его материала и каждое из разведений вносят во флакон или чаш ку со слоем культуры клеток. Подсчитав образовавшиеся бляш ки (с учетом раз­ ведения вируса), вычисляют титр вируса — количество вирионов в 1,0 мл исходного материала. Титр вируса, оп ­ ределяемый методом бляш ек, принято выражать числом бляш кообразую щ их единиц (БОЕ) в 1 мл.

Идентификация вирусов и титрование антител.

Метод бляш ек дает возмож ность провести точную иден­ тификацию вируса с помощ ью диагностических специфи­ ческих сы вороток. При соответствии между сы вороткой и вирусом происходит нейтрализация вируса и при зара­ жении монослоя клеток такой см есью бляш ки не образу­ ются или их количество значительно снижается. Благо­ даря своей чувствительности и точности метод приобрел большое значение в изучении тонких антигенных разли­ чий у вирусов.

С пом ощ ью метода бляшек удается также обнаружить антитела в сы воротке больных и определить их титр, что имеет диагностическое значение. За титр сыворотки при­ нимают ее наибольшее разведение, снижающ ее количе­ ство бляш ек на 50% .

Цветная проба

Цветная проба (или цветная реакция) основана на раз­ нице в цвете среды с индикаторам фенолрот, в которой растет нормальная, ж изнеспособная культура клеток, и среды, где находится культура, зараженная вирусом.

В процессе развития нормальной культуры клеток про­ исходит постепенное накопление кислы х продуктов обме­ на вещ еств, что приводит к сдвигу pH в кислую сторону. Такое изменение реакции среды говорит о наличии роста и размножения клеток. Среда с индикатором фенолрот, первоначально имевшая красный цвет (исходное значение

10 2 Общ ая медицинская вирусология

pH 7 ,4 -7 ,6 ), вследствие снижения pH до 7 ,0 -6 ,8 приобре­ тает ж елт ый цвет .

Заражение культуры клеток вирусом приводит к раз­ витию в ней дегенеративных процессов: происходит по­ давление процессов метаболизма, значительно пониж ает­ ся гликолиз, в результате чего кислы х продуктов накап­ ливается мало, pH среды остается на исходном уровне и среда с индикатором фенолрот остается красного цвета.

Так, по сохранению красного цвета среды или перехо­ ду его в ж елтый можно судить о наличии или отсутствии вируса в исследуемом материале, внесенном в культуру клеток.

С помощ ью цветной реакции мож но определить соот ­ ветствие вируса и вируснейтрализующ ей сы воротки, если их предварительно смешать и эту смесь после инкубации внести в культуру клеток. Специфическая сыворотка ней­ трализует вирус и он не оказывает цитопатическое дей­ ствие на клетки культуры . П оэтом у клетки продолжают нормально ж ить и размножаться, что приводит к перехо­ ду среды в желтый цвет.

Таким образом, цветную реакцию используют:

1)для выявления вируса и его титрования;

2)с целью идентификации вируса по нейтрализующ е­ му действию специфической сыворотки;

3)для обнаружения и титрования вируснейтрализую- щ их антител в исследуемых сы воротках.

Цветная проба получила ш ирокое применение в диаг­ ностике полиомиелита, при инфекциях, вызываемых ви ­ русами К оксаки А и В, ECHO, аденовирусами и некото­ рыми арбовирусами.

У словия постановки. Ц ветную пробу ставят с различ­ ными типами клеточных культур. Чаще берут первичную культуру клеток почки обезьяны или перевиваемые куль­ туры клеток.

Оценка результатов цветной пробы проводится по из­ менению цвета среды через определенный срок культиви­ рования клеток.

вать, что каждая культура клеток, на которой ставят ре­ акцию, имеет определенный уровень метаболизма. П оэто­ му постановке цветной пробы обязательно предшествует определение метаболической активности клеток культу­ ры, на которой собираются ставить цветную реакцию. У с­ танавливают так называемую дозу клеток для цветной реакции, то есть то оптимальное количество клеток, к о ­ торое долж но быть взято в каж дую пробирку.

Определение дозы клеток. При работе с культурой по­ чечных клеток обезьяны готовят взвесь клеток густотой 100 -120 ты с. в 1 мл. Из нее делают ряд возрастающ их двукратных разведений в объеме 0,25 мл и определяют минимальное количество клеток, которое при постановке цветной пробы изменяет цвет питательной среды из крас­ ного в ж елтый на 5 -6 -й день выдерживания в термостате; это количество и принимается за дозу клеток. Обычно эта доза — 25 ты с. клеток в объеме 0,25 мл.

На воспроизводимость результатов цветной пробы, кро­ ме типа применяемых клеток и их концентрации, влия­ ют такж е состав, буферность pH питательной среды.

Титрование вируса методом цветной пробы

Ц ветную пробу ставят в пробирках. (Возможна поста­ новка реакции в луночках плексигласовых пластин.) П ро­ бирки иногда закрывают резиновыми пробками, но чаще разобщение от атмосферного воздуха достигается наслаи­ ванием стерильного вазелинового масла (0 ,6 -0 ,8 мл) или применением алюминиевой фольги. Однотипную опытную смесь наливают не в одну, а в четыре пробирки, что повы ­ шает достоверность реакции.

При оценке результатов реакции учитывают только два тона: желтый и красный (табл. 7).

При титровании вируса по цветной пробе готовят де­ сятикратны е разведения вируссодерж ащ его материала. Эти разведения вируса, взятые в объеме 0,25 мл, см еш и­ вают с 1 дозой клеток, содерж ащ ейся в таком же объеме,

1 04 Общ ая медицинская вирусология

добавляют питательную среду по 0,25 мл и наслаивают вазелиновое масло по 0 ,6 -0 ,8 мл. В реакции ставят контроли клеточной взвеси: берут 1, У 2 и 1/ 4 дозы клеток. Эти контроли подтверж дают правильность выбора дозы клеток. П робирки помещ аю т на 5 -6 дней в термостат при 37 С после чего по изменению цвета учиты ваю т ре­ акцию .

Титром вируса по цветной пробе называется то наи­ большее разведение вируса, которое вызывает подавление метаболической активности клеток в 50% случаев. В дан­ ном примере (табл. 7) титр вируса равен 10 4 (две пробир­ ки красные, две — желтые). Количество вируса, содерж а­ щееся в объеме 0,25 мл в разведении, равном титру, на­ зывается цитопатической дозой (ЦПД50) вируса.

Реакция нейтрализации по цветной пробе

При постановке цветной реакции с определяемым ви ­ русом, предварительно смеш анным с соответствую щ ей вируснейтрализующ ей сы вороткой, вирус инактивирует­ ся и не подавляет ж изнедеятельности клеточной культу­ ры, что доказывается переходом цвета среды в желтый. По результатам цветной пробы мож но судить о наступив­ шей реакции нейтрализации, свидетельствующ ей о соот ­ ветствии вируса и сы воротки, таким образом идентифи­ цировать исследуемый вирус.

Обычно методом цветной пробы определяют наличие и титр антител в сыворотке больны х; наибольшее значение она имеет для определения антител у больных полиомие­ литом, а такж е у иммунизированных полиомиелитной вакциной людей (табл. 8).

При титровании антител методом цветной пробы в ка­ честве антигена берут известный, заранее оттитрованный вирус в рабочей дозе, равной 100 ЦПД50. В нашем приме­ ре (табл. 8) доза 100 ЦПД50 вируса содержится в 0,25 мл разведения 10~2.

К приготовленным двукратно возрастающим разведе­ ниям исследуемой сы воротки в объеме 0,25 мл (каж дое

Таблица 7

Схема титрования вируса методом цветной пробы

вируса в равном объеме. Полученные смеси выдерживают при комнатной температуре 1 -2 часа (чтобы могла про­ изойти реакция нейтрализации), после чего в пробирки добавляют взвесь клеток в количестве одной дозы, также в объеме 0,25 мл. В реакции ставят контроль дозы клеток и контроль сы воротки на токсичность. Иногда сыворотка может оказывать на культуру клеток токсичное действие: клетки гибнут, не накапливая кислых продуктов, и цвет среды остается красным. Учет результатов реакции нейт­ рализации по цветной пробе производится через 7 -9 дней инкубирования при 37 °С при наличии правильных ре­ зультатов в контролях.

Тит ром реакции ( т ит ром сы ворот ки) называется максимальное разведение сы воротки, которое еще подав­ ляет в 50% случаев действие 100 цитопатических доз ви ­ руса. В нашем примере титр равен 1:64 (табл. 8).

3.5. Применение реакции гемагглютинации (рга), реакции торможения гемагглютинации (ртга)

ибиологических экспериментальных моделей для индикации и идентификации вирусов

Явление гемагглютинации — склеивания эритроцитов под действием вирусов впервые обнаружил Херст (1941 г.). Было выявлено, что вирус гриппа агглютинирует эритро­ циты кур, и разработана реакция гемагглютинации. П оз­ же было установлено, что гемагглютинирующ ими свой ­ ствами обладают и многие другие вирусы (больш инство парамиксовирусов, поксвирусов, рабдвирусов, некоторые энтеровирусы, флавивирусы, аденовирусы и др.).

М еха н и зм , ст адии реакции . Гемагглютинация, вы ­ зываемая вирусами, не является иммунологической ре­ акцией, так как здесь нет системы антиген — антитело. С пом ощ ью этой реакции легко выявить присутствие гемагглю тинирую щ его вируса, но невозмож но его иденти­ фицировать.

108 Общая медицинская вирусология

Вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойства­

ми, имеют на поверхности гем аггл ю т и н и н ы , с помощ ью которы х и происходит склеивание эритроцитов. По св о ­ ей хим ической природе гемагглютинины являю тся глико- или липопротеидами. У слож ны х вирусов они стр ук ­ турно связаны с ворсинками, у просты х вирусов — с капсидом.

В процессе взаимодействия вирусов с эритроцитами различают стадии адсорбции, агглютинации и элю ции.

А дсорбция вирусов на эритроцитах начинается как не­ специф ическая, а затем переходи т в спец иф и ческую вследствие сродства гемагглютининов к рецепторам эрит­ роцитов. На одном эритроците адсорбируется множ ество вирусов, они образуют мостики меж ду эритроцитами, из­ меняется электростатический заряд эритроцитов и в ре­ зультате наступает следующ ая стадия взаимодействия — гемагглютинация, на которой процесс мож ет остановить­ ся. Н екоторы е вирусы способны к элюции — освобож де­ нию с поверхности эритроцитов. Элюция происходит под действием вирусны х ферментов (например, нейраминидазы) на рецепторы эритроцитов. Элюированные вирусы при этом не повреж даю тся, эритроциты же не способны повторно адсорбировать вирус вследствие разрушения ре­ цепторов.

При постановке реакции гемагглютинации (РГА) ста­ раются использовать именно те эритроциты (птиц, ж и ­ вотных, человека), с которыми гемагглютинирующие свой­ ства данного вируса вы являю тся лучше; чаще всего гемагглютинацию ставят с эритроцитами кур. Обычно РГА ставят при комнатной температуре, реже при 4 °С или 37 °С. Н еобходимо также учитывать значение pH, элект­ ролитный состав среды.

Задерживающее действие на РГА могут оказать ин ги ­ би т оры , содержащ иеся в тканях, где размножался ви ­ рус, и других биологических субстратах. Для снятия ин ­ гибиторного действия вируссодерж ащ ие материалы про­ гревают, обрабатывают трипсином, ацетоном и др.