Вирусология общая Горячкиной

40 Общ а я м е д и ц и н с к а я вирусо ло гия

Макрофаги

Существенным фактором в противовирусном иммуни­ тете являются макрофаги. Они принимают участие в им­ мунной стимуляции, являясь антигенпрезентирующими клетками в распознавании вирусных антигенов.

М акрофаги участвую т в освобож дении организма от вирусов. Они активно поглощают вирусы как по типу обыч­ ного фагоцитоза, так и при помощ и опсонинов (Ig, СЗЬ). М акрофаги такж е проявляю т цитотокси ческую актив­ ность, разрушая клетки, зараженные вирусами. Цитотоксическая активность макрофагов имеет неспецифический характер и проявляется на ранних стадиях инфекционно­ го процесса.

2 .3 .2 . Специфические гуморальные факторы противовирусной защиты

Если вирусу удается преодолеть барьеры естественной защ иты, он вызывает развитие специфического иммунно­ го ответа, что сопровож дается появлением факторов кле­ точного иммунного ответа и специфических противови­ русных антител.

Специфические антитела

М еханизмы гуморального противовирусного иммуни­ тета могут быть различными и зависят, главным образом, от локализации вирусов — внеклеточной или внутрикле­ точной. В противовирусной защите ведущая роль принад­ лежит иммуноглобулинам классов IgG, IgM, IgA.

Н а внеклет очный вирус (вирион) ант ит ела оказыва­ ют следующ ее воздейст вие:

1.Специфические антитела способны осущ ествлять пространственную блокаду вирусных прикрепитель­ ных белков свободной вирусной частицы . В резуль­ тате этого процесса предотвращается связывание вириона с клеточными рецепторами. П оскольку на поверхности вириона прикрепительные белки пред­

ставлены во множ ественных копиях, нейтрализа­ ция по этому типу требует связывания с вирионом более одной молекулы антител. Высокая концент­ рация специфических антител, нейтрализующ их вирус, способна предупредить проникновение и ин­ фицирование вирусом новых клеток и тканей и, наоборот, связанные с недостаточным числом ан­ тител вирусы могут прикрепляться к клетке и вы ­ зывать инфекционный процесс.

2.В нейтрализации слож но устроенны х вирусов, по­ мимо антител, требуется участие системы компле­ мента. Образование комплекса меж ду вирионом и антителами вызывает активацию системы компле­ мента по классическому пути, появлению мембра­ ноатакующ его комплекса и разруш ению суперкапсида вируса, что ведет к необратимой деструкции вириона.

3.Антитела, связанные с вирусными частицами, опсонизируют фагоцитоз, что ведет к бы строму зах­

вату и уничтож ению вируса.

Борьба с внут риклет очным вирусом идет при помо­ щи других механизмов.

1.Антитела способны вызывать разрушение клетки, зараженной вирусами, активируя систему компле­ мента. В результате активации комплемента про­ исходит образование мембраноатакующ его ком п ­ лекса и лизис зараженной клетки. Этот компле- мент-зависимый цитолиз происходит только при высокой экспрессии вирусных антигенов на мемб­ ране клетки.

2.При невы сокой экспрессии вирусны х антигенов наиболее эффективным защ итным механизмом яв­ ляется антителозависимая клеточная цитотоксич ­ ность (АЗК Ц ). Такие клетки с представленными вирусными антигенами связы ваю тся с иммуногло­ булинами. Следующим этапом является связы ва­ ние нагруженных антителами клеток через Гс-фраг- мент Ig с цитотоксическим и клетками — нормаль­

Ц итолитическое действие имеет место при всех виру­ сных инфекциях и наряду с ИФ является основным фак­ тором противовирусного иммунитета. Ц итолитическое действие играет ведущ ую роль:

-против вирусов, освобож даю щ ихся из клетки -хозя­ ина почкованием;

-при тех инфекциях, при которы х вирусы распрост­ раняются через мембраны в соседние клетки, ми­ нуя экстрацеллю лярную среду;

-против клеток, пораженных онкогенными вирусами.

Только при вирусных инфекциях, при которы х виру­ сы быстро разрушают пораженные клетки, например, при пикорнавирусных, аденовирусных и некоторы х других инфекциях, клеточны й иммунитет не имеет больш ого значения.

Иммунопатология при вирусных инфекциях

Иммунный ответ организма при вирусных инфекциях иногда может сопровож даться развитием иммунопатоло­ гических реакций, таких как:

-образование иммунных комплексов;

-развитие иммунодефицитов;

-развитие аутоиммунных заболеваний;

-повышение активации Т-лимфоцитов, что ведет к

повреждению тканей.

При взаимодействии вируса с антителами могут обра­ зовываться иммунные комплексы ( И К ) , в которы х виру­ сы изолируются от клеток, но не обезвреживаются и со ­ храняют свою инфекционную активность.Ч ащ е всего это явление имеет место при избытке вирусного антигена и недостаточной концентрации антител, когда антитела те­ ряют способность нейтрализовать вирусы . Образующиеся иммунные комплексы фиксирую тся на клетках, содерж а­ щих рецепторы к F -фрагменту иммуноглобулина (нейтрофилы, базофилы, макрофаги, тучные клетки и др.), что создает возмож ности для прикрепления к клетке, изме­ нения ее метаболизма и проникновения вируса в клетку.

44 Общ а я м е д и ц и н с к а я вирусо ло гия

Мелкие ИК могут фиксироваться на базальной мемб­ ране клубочков в почках и вызывать гломерулонефриты. Оседая на кровеносных сосудах органов, ИК способству­ ют увеличению проницаемости сосудов, что мож ет выз­ вать проникновение вирусов в забарьерные органы (мозг, тестикулярную ткань, роговицу глаза), появлению анти­ тел против забарьерных тканей (аут оант ит ел), раз­ витию воспалительных реакций и повреждению тканей (орхит, менингит и др.).

Вирусы, сохраняющ ие активность в составе иммунных комплексов, являю тся одной из основных причин разви­ тия хронических форм вирусных инфекций.

Длительно текущ ий инфекционный процесс причиня­ ет ущерб репарационным системам макроорганизма, что в свою очередь создает условия для длительного персистирования вирусов.

При многих вирусных инфекциях повреж даются тка­ ни, возникают вторичные инфекции, что является след­ ствием активности Т-клеток (ауто-Т-лимфоцитов). Этот механизм имеет место в патогенезе хронического вирус­ ного гепатита.

Таким образом, вирусная инфекция мож ет провоциро­ вать возникновение аутоиммунных заболеваний.

Н екоторые вирусы , например, ВИЧ, непосредст венно инфицируют лимфоциты и макрофаги, вызывая синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД).

Глава 3.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ВИРУСОЛОГИИ

3.1.Подготовка материала для вирусологических исследований. Микроскопические методы

исследования в вирусологии

Правила работы в вирусологической лаборатории

Современная вирусология — самостоятельная область науки с собственными методами исследования и специ­ альными задачами, выполнение которы х осущ ествляется

ввирусологических лабораториях и институтах. Правила работы в вирусологической лаборатории обус­

ловлены своеобразием свойств вирусов и их вы сокой инфекциозностью, в связи с чем многие методы исследова­ ния требуют соблюдения ряда обязательных условий, не являющихся необходимы ми для бактериологических и серологических лабораторий.

В вирусологической лаборатории проводят работу по выделению ш таммов вирусов, их идентификации и куль­ тивированию, вы полняются различные научные исследо­ вания. При работе с вирусами необходимо прежде всего: 1) не допустить загрязнения ш таммов вирусов посторон ­ ней микрофлорой; 2) обеспечить безопасность работающего персонала от возмож ного заражения вирусами, особенно при работе с аэрозолями; 3) обеспечить безопасность о к ­ ружающего населения от заражения вирусными инфек­ циями через сточны е воды, трупы экспериментальных животных и т.п. С учётом выполнения этих основны х требований организуется вирусологическая лаборатория и устанавливается режим работы в ней.

Вирусологическая лаборатория должна размещ аться в чистых, светлых помещ ениях, изолированных от других лабораторий, или же в отдельных зданиях. Помещения оснащаются оборудованием, необходимым для вирусоло­

46 Общ а я м ед и ц и н с к а я вирусо ло гия

гических исследований. Независимо от выполняемой ра­ боты, в вирусологической лаборатории необходимо под­ держивать идеальную чистоту.

Крупная вирусологическая лаборатория обычно состо­ ит из нескольких специализированных отделов, предназ­ наченных для работы с вирусами: для приготовления кле­ точных культур, для проведения серологических иссле­ дований in v itro и in vivo (на ж ивотны х и куриных эмбрионах); имеется отдел физических методов исследо­ вания вирусов (электронноскопия, ультрацентрифугиро­ вание и др.). Н еобходим также моечно-автоклавный блок, виварий, где здоровые и заражённые ж ивотные надёжно изолированы друг от друга, а также ряд подсобных поме­ щений — санпропускники, душ евые, помещ ения для сте­ рилизации отходов, комната для вентиляционной уста­ новки и др. Чем крупнее вирусологическое учреждение (лаборатория, институт), тем больше специальных поме­ щений оно содерж ит.

Лабораторные помещения, предназначенные для «чис­ той» работы с вирусами и с культурами клеток должны состоять из предбоксника и бокса, разделённых стеклян­ ной перегородкой. В предбоксниках в специальных биксах хранятся надеваемые перед работой в боксе стерильные халаты, ш апочки, маски, резиновые перчатки и др. При работе с заразным материалом часто надевают защитные очки, а в особо опасных случаях респираторы или проти­ вогазы. В предбоксниках можно проводить различные вспо­ могательные работы, требующие меньшей стерильности. Основные вирусологические исследования ведутся в боксе. Стол в боксе должен быть экранирован с помощ ью защит­ ного стекла для предохранения работающих от заражения. Для этой же цели применяют настольные боксы с бактери­ цидной лампой внутри. Помещение бокса должно быть оборудовано таким образом, чтобы можно было произво­ дить влажную уборку стен, потолка и пола. Кроме того, до и после работы боксы обеззараживают кварцевыми бакте­ рицидными лампами. В процессе работы в бокс рекомен­ дуется подавать стерильный воздух.

По окончании работы с инфекционным материалом все отходы должны помещаться в металлические баки с кры ш ­ ками и обеззараживаться на месте с помощ ью дезинфи­ цирующего раствора. Только после этого баки отправля­ ют в специальное помещ ение, где отходы повторно дезин­ фицируют, автоклавируют и частично сж игаю т. Воздух, поступающий из боксов, стерилизуют с помощ ью специ­ альных фильтров.

Сотрудников вирусологических лабораторий обязатель­ но вакцинируют против всех тех вирусных инфекций, с возбудителями которы х возмож ны контакты во время работы. Весь персонал должен строго соблюдать правила внутреннего распорядка, направленные на предупреж де­ ние возмож ности лабораторного заражения вирусными заболеваниями.

Работа с вирусами, особо опасными для человека, и их переносчиками допускается в лабораториях, имеющ их спе­ циальное разрешение противоэпидемического управления Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Методы исследования, применяемые в вирусологии

Эти методы отличаются значительной слож ностью , что связано прежде всего с абсолютным внутриклеточны м паразитизмом вирусов и их малыми размерами.

При исследовании материалов, полученных от больных вирусными инфекциями, с целью лабораторной диагнос­ тики этих заболеваний применяются различные методы:

-методы электронной и в меньшей степени световой микроскопии;

-методы выделения и культивирования вирусов в культурах клеток (с выявлением их цитопатического действия, способности к гемадсорбции и других проявлений действия вирусов на клетки);

-методы выделения и культивирования вирусов в раз­ вивающ ихся курины х эмбрионах и в организме чув­ ствительных экспериментальных ж ивотны х;

-выявление вирусов по их гемагглютинирующей спо­ собности;

-различные серологические методы исследования: традиционные серологические реакции (реакция свя­ зывания комплемента, преципитации в геле и др.)

иэкспресс-методы ; наибольшее значение имеет ре­ акция нейтрализации вирусов специфической вируснейтрализующей сы вороткой, которую проводят на различных биологических объектах (культурах кле­ ток, куриных эмбрионах, реже — на ж ивотных) с целью идентификации вирусов, определения вирус­ ных антигенов или антител;

-молекулярно-генетические методы исследования —- молекулярная гибридизация и полимеразная цеп­

ная реакция.

Таким образом, в вирусологии применяют как специ­ альные вирусологические методы исследования, так и общепринятые микробиологические.

Ниже приведены основные методы работы с вирусами.

Материалы, исследуемые при вирусных инфекциях

При взятии инфекционного материала от людей и жи­ вотных необходимо учитывать тропизм вирусов к опреде­ ленным тканям и органам, пути выделения вируса во вне­ ш нюю среду и особенности патогенеза той или иной ви­ русной инфекции. Учет всех этих факторов позволяет правильно и в нуж ный срок взять инфекционный мате­ риал, что способствует успеху исследования.

Тканевой (органный) тропизм — способность вида ви­ руса к размножению в определенных чувствительных клет­ ках с дальнейшим развитием специфического патологи­ ческого процесса в соответствую щ их тканях и органах инфицированного данным вирусом организма. Тканевой тропизм вирусов определяется как наличием на клетках специфических рецепторов, так и возмож ностью вируса репродуцироваться в клетках.

Различают пневмотропные, энтеротропные, гепатотропные, лимфотропные, нейротропные и дермотропные ви ­ русы. В зависимости от тропизма исследованию подверга­ ют различные материалы. Например, исследую т слизь из зева, мокроту и т.п ., если вирус пневмотропный; испраж ­ нения — при энтеротропны х вирусах; ж идкость из вези­ кул или пустул, корочки — если вирус обладает дермотропностью и т.д.

Подразделение вирусов по тропизму до некоторой сте­ пени условно. Имеется целый ряд вирусов, которые не укладываются в рамки данной схемы . Н есмотря на это подразделение вирусов по тропизму весьма удобно для практической работы.

Обработка вируссодержащего материала

Инфекционные материалы, взятые с учетом тропизма вирусов и с соблюдением асептики, помещ ают в стериль­ ную посуду, тщательно закупоривают её и направляют в лабораторию, поместив в термос со льдом.

Материал рекомендуется исследовать в кратчайший срок, так как вирусы, как правило, быстро инактивиру­ ются. Сохранению вируса способствует помещение иссле­ дуемого материала (в 50% -ном растворе глицерина) в х о ­ лодильник при температуре не выше 5 С. Но самый на­ дёжный способ — это хранение в замороженном состоянии при температуре — 45 °С и ниже; в таких условиях вирус может оставаться ж изнеспособным длительное время.

Обработка плотного материала, содерж ащ его вирусы, начинается с растирания его в ступке или измельчения в специальных аппаратах — гомогенизаторах. Затем гото­ вится 10% -ная взвесь в солевом растворе, которую цент­ рифугируют при 200 0 -30 00 об/м ин в течение 1 5 -3 0 ми­ нут для осаждения крупных частиц. Вирусы остаю тся в надосадочной ж идкости, которую и подвергают дальней­ шему исследованию.

Жидкий вируссодерж ащ ий материал непосредственно центрифугируют и такж е получают надосадочную ж ид ­ кость.