Вирусология общая Горячкиной

70 Общ ая медицинская вирусология

лению его к стеклу, поэтому при их связывании клетки разъединяются и отделяются от стекла при лёгком встря­ хивании.

П олученную клеточную взвесь центрифугируют при 1000 об/м ин в течение 1 0 -15 минут, надосадочная ж ид­ кость удаляется, а к осадку клеток добавляют свежую питательную среду. После подсчёта клеток в камере Го­ ряева устанавливают концентрацию 100 000 клеток в 1 мл с помощ ью дальнейшего разведения питательной средой. Полученную взвесь клеток разливают по 1 мл в стериль­ ные пробирки, которые закрывают резиновыми пробка­ ми и инкубируют в термостате в наклонном положении.

Для культивирования перевиваемых культур клеток применяют среду 199 (часто с добавлением 10% бычьей сы воротки), среду Игла с добавлением 20% сы воротки, 0,5% гидролизат лактальбумина, содержащ ий 5% теля­ чьей сы воротки.

в) Культуры диплоидных клеток Культуры диплоидных клеток ещё называют полупе-

ревиваемыми культурами, так как они обладают способ­ ностью к пересевам в течение длительного времени — вы ­ держивают до 4 0 -5 0 пассажей, проводимых на протяж е­ нии 8 -1 0 месяцев. Затем культура клеток подвергается дегенерации и гибнет. Диплоидными культурами их на­ зывают, потом у что они стойко сохраняю т диплоидный кариотип, присущий исходным нормальным клеткам орга­ низма — родоначальницам диплоидной линии.

Культуры диплоидных клеток получают из различных тканей эмбриона человека, из первичных культур. Так, например, пользуется известностью штамм ДКЛЧ (дип­ лоидные клетки лёгких человека), ш таммы W JT -38, JM R -90, MRC-5 из лёгочной ткани эмбриона человека.

Диплоидные культуры характеризуются быстрым раз­ множ ением клеток, хорош ей ж изнеспособностью (они выживают до 4 недель при еженедельной смене среды), они обладают чувствительностью ко многим вирусам. Диплоидные культуры, как правило, не заражены микоп­ лазмами и латентными вирусами. Они хорош о сохрани-

ю тся в заморож енном состоянии при температуре ниже -70°С. Важное условие успеш ной работы с диплоидными культурами — наличие большого запаса ампул с дипло­ идными клетками ранних делений. Такими диплоидны ­ ми культурами мож но пользоваться практически в без­ граничном количестве пассажей, размораживая поочерёдно ампулы диплоидных клеток одну за другой и поддерж и­ вая каж дую из культур в течение 4 0 -5 0 пассажей.

Культуры диплоидных клеток применяют для выделе­ ния и культивирования вирусов. Но поистине незамени­ мыми они оказались в производстве культуральных вирус­ ных вакцин. Диплоидные клетки чувствительны ко мно­ гим штаммам вирусов, онкогенно безопасны, пригодны для культивирования в промышленных масштабах и получе­ ния массового количества вирусных вакцин. Применяемые диплоидные штаммы проходят систематический контроль на отсутствие контаминации вирусами и другими микро­ организмами, кариологический контроль с определением количества хромосом и анализом кариотипа.

Кроме стационарных однослойных клеточных культур применяют и роллерны е однослойные культуры клеток, выращиваемые на стенках вращ ающ ихся цилиндричес­ ких сосудов, что значительно увеличивает поверхность, на которой растет клеточный монослой. В роллерных куль­ турах выход вируса на единицу питательной среды возра­ стает в 1 0 -2 0 раз, поэтому этот метод нередко использу­ ют для производственных целей.

Также весьма продуктивны суспензионны е культуры.

Культуры суспензированных клеток

Суспензированная культура — это культура, в которой отдельные клетки или их конгломераты постоянно нахо­ дятся во взвешенном состоянии в ж идкой среде.

Культуры клеток в суспензии удаётся получить, если проводить их культивирование при постоянном интенсив­ ном перемешивании среды. В таких условиях клетки не могут осесть и прикрепиться к стеклу, их рост и размно­ жение происходят во взвешенном состоянии.

Культивирование клеток в суспензии хорош о удаётся с перевиваемыми культурами клеток (обы чно в среде Игла). Перемешивание среды достигается путём вращ е­ ния пробирок в барабане, с помощ ью магнитной мешалки и т.п. В последнее время используют специальные аппа­ раты — хем остаты , в которы х обеспечивается автомати­ ческое обновление среды . Удобно культивировать клеточ­ ные суспензии в реакторах, снабжённых лопастными про­ пеллерами. Суспензированные клетки обладают большей активностью роста, накапливаются в большом количестве, при регулярной замене среды длительное время остаются жизнеспособны ми.

Суспензионные культуры пригодны для непосредствен­ ного заражения вирусами, которы е в них накапливаются весьма интенсивно. Или же взвеси суспензированных кле­ ток использую т для получения стационарных или роллерных однослойны х культур клеток.

3.3. Выделение и культивирование вирусов в куриных эмбрионах и в организме лабораторных животных

3 .3 .1 . Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах

Культивирование вирусов в курины х эмбрионах ш и ­ роко применяется в вирусологии как для первичного вы ­ деления вирусов из инфекционного материала, так и для дальнейш его их культивирования путем пассажей. М е­ тод культивирования вирусов в курины х эмбрионах и с­ пользую т при лабораторной диагностике вирусны х ин ­ фекций и в научных исследованиях. С помощ ью этого метода получаю т большое количество вируссодерж ащ е­ го материала для изготовления вакцин и диагностичес­ ких препаратов.

Выявлено, что многие вирусы , поражающ ие человека и ж ивотны х, могут в большей или меньшей степени раз­ множ аться в курином эмбрионе. Наличие плотной ск ор ­

76 Общ ая медицинская вирусология

лупы защ ищ ает эмбрион от попадания микроорганизмов из внешней среды и, таким образом, вирусы размножают­ ся в стерильных условиях. Как правило, у эмбрионов от­ сутствую т латентные вирусные инфекции, что выгодно отличает их от лабораторных ж ивотны х.

Из недостатков этого метода наиболее значительны следующие: 1) невозможно наблюдать в динамике за па­ тологическими изменениями, происходящ ими в эмбрио­ не после заражения его вирусом; 2) при вскрытии эмбри­ она, зараженного вирусом, часто не обнаруживается ви ­ димых изменений и приходится выявлять наличие вируса в тканях, в ж идкостях эмбриона, пользуясь другими ви ­ русологическими методами (например, реакцией гемагглютинации); 3) невозможно проследить за нарастанием тит­ ра антител, что хорош о выявляется в опытах на ж ивот­ ных; 4) метод культивирования в курины х эмбрионах пригоден не для всех вирусов, т.е. не является вполне универсальным.

Несмотря на имеющ иеся недостатки метод культиви­ рования вирусов в куриных эмбрионах сравнительно прост, удобен и дешев и ш ироко используется в вирусологичес­ ких исследованиях. Наибольшее значение он имеет при работе с ортомиксовирусами, герпесвирусами, поксвирусами (см. график 4, стр .78).

Ст роение куриного эм бриона. Куриный эмбрион по­ крыт известковой оболочкой — скорлупой, к которой из­ нутри примыкает скорлупная оболочка. В тупом конце яйца она раздваивается и заключает в себе воздушное про­ странство. П од скорлупной оболочкой находится хорионаллантоисная оболочка, в тупом конце яйца она прохо­ дит по внутренней стороне скорлупной оболочки, замы ­ кающ ей воздуш ное пространство. Эта оболочка богата кровеносными сосудами и служит эмбриону органом ды ­ хания. Изнутри к ней прилегает аллантоисная полость, которая является органом выделения и защищает заро­ дыш от высыхания и травм. Аллантоисная полость окру­ жает зародыш , находящ ийся в полости амниона, которая наполнена околоплодной ж идкостью . Через желточный

канатик зародыш соединен с желточным меш ком — ос­ новным источником питательных вещ еств. На поздних этапах развития эмбрион получает питательные вещества и из белочного мешка, располож енного в остром конце яйца.

Рис. 2. Схема строения куриного эмбриона

(9 дней инкубации)

П одгот овит ел ьная работ а. Для успеш ного культи­ вирования вирусов в организме развивающ ихся куриных эмбрионов требуется определенный температурный режим (обычно 3 6 -3 8 °С), влажность (5 0 -7 0 % ), а также доста­ точная вентиляция. Заражают куриные эмбрионы опре­ деленного возраста, инкубированные от 6 до 13 дней в зависимости от вида вирусов и метода заражения. Дол­ жен быть выбран правильный метод заражения и подо­ брана оптимальная заражающая доза вируса в соответ­ ствии со свойствами вируса и задачами исследования. Все операции по заражению и вскры тию яиц необходимо про­ водить с соблюдением асептики, желательно в боксе.

Для работы должны быть подготовлены: подставка для яйца, пузырьки со спиртом и йодом, пробирка со стериль­ ным парафином, покровные стекла, пакетики стерильной ваты, марли, завернутая в бумагу стерильная посуда; сте­ рильные ш прицы , иглы, пинцеты, препаровальные иглы.

Инструменты помещ аю т в стаканчик со спиртом, где они находятся в течение всей работы, перед каждой манипу­ ляцией их дополнительно стерилизуют обжиганием в пла­ мени горелки. Руки перед работой тщ ательно мою т, реко­ мендуется надеть маску из марли.

Для работы отбираю т ж изнеспособные эмбрионы, про­ свечивая инкубированные яйца в овоскопе — специаль­ ном ящ ике с подсветкой. Через просвечивающ ую скорлу­ пу виден эмбрион, сосуды хорионаллантоисной оболочки, границы воздуш ного меш ка. Ж изнеспособны й эмбрион подвижен, кровеносные сосуды оболочки заполнены кро­ вью. На скорлупе яйца отмечают карандаш ом границы воздуш ного меш ка и положение эмбриона.

Отобранные яйца тщательно дезинфицируют на тупом конце (или на боковой стороне яйца): скорлупу протира­ ют спиртом; смазывают йодом; повторно обрабатывают спиртом и, как правило, обж игают.

Методы заражения куриного эмбриона

Заражение на хорионаллантоисную оболочку. Этот метод является одним из наиболее употребительных. Ос­ новное преимущ ество его в том, что ряд вирусов при раз­ множении на хорионаллантоисной оболочке вызывают ее характерные изменения, образуя очаги поражения в виде беловатых пятен-бляш ек различной морфологии.

Для заражения используют эмбрионы 10-12-дневного возраста. Обычно к хорионаллантоисной оболочке прони­ кают, сделав отверстие в скорлупе над воздуш ным меш ­ ком или же на боковой стороне яйца.

Основные этапы заражения на хорионаллантоисную оболочку со стороны воздуш ного пространства:

1.Яйцо помещ ают на подставку в вертикальном по­ ложении так, чтобы воздуш ный меш ок находился наверху; проводят тщательную стерилизацию скор­ лупы на тупом конце яйца.

2.Над центром воздуш ного меш ка делают прокол скорлупы с помощ ью препаровальной иглы.