Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

Вирусология общая Горячкиной

.pdf
Скачиваний:
600
Добавлен:
13.02.2016
Размер:
3.06 Mб
Скачать

60

Общ ая м едицинская вирусология

Таблица 4

Состав солевых растворов (в г на л)

Вещества

Раствор Хенкса

 

Раствор Эрла

NaCl

 

8,0

 

6,8

КС1

 

0,4

 

0,4

CaCl,

0,14

 

0,2

MgS04 х

7Н20

0,1

п

0,1

MgS04 х 6Н20

0,1

 

NaH,P0„ х Н ,0

 

0,125

N aH /O , х 2Н20

0,06

 

KH..P0,

0,06

 

2

4

 

 

 

Глюкоза

1,0

 

1,0

Фенолрот (не всегда)

0,02

 

0,05

NaHC03

0,35

 

2,2

Вирусологические питательные среды

Питательные среды для клеточных культур в большин­ стве случаев готовят на основе солевых растворов. Разли­ чают:

1)естественные питательные среды (применяют редко);

2)ферментативные гидролизаты белковых веществ;

3)синтетические питательные среды.

Естественные питательные среды

Естественные питательные среды готовят на осн о­ ве солевых растворов Хенкса и Эрла, к которы м добавля­ ют сы воротку, амниотическую ж идкость, эмбриональный экстракт. Эти биологические ж идкости являются источ­ никами белкового питания, витаминов и других веществ, способствую щ их росту и размножению клеток.

Сыворотки (нативные или диализованные). Использу­ ют нормальные сыворотки человека, лошади, коров (луч­ ше телят), кур, кроликов и некоторые другие. Сыворотки должны храниться на холоде. Перед употреблением каж ­

Г лава 3 . М ето д ы исследования в вирусологии

6 1

дая сы воротка должна быть проверена на отсутствие ток ­ сичности для клеточных культур.

Амниотическую ж идкость обычно извлекают из к о ­ ровьих маток (доставленных с бойни) с соблюдением асеп­ тики. Ж идкость сохраняется во флаконах с резиновыми пробками.

Эмбриональные экстракты чаще всего готовят из к у ­ риных эмбрионов, обычно 9-11-дневного возраста. Тело эмбриона измельчают, добавляют равный объём раствора Хенкса, центрифугируют при 2000 -3000 об/мин в течение 30 минут. Полученная надосадочная жидкость и является эмбриональным экстрактом, который хранят в пробирках с резиновыми пробками в замороженном состоянии.

Все перечисленные биологические жидкости и экстрак­ ты в случае необходимости мож но стерилизовать фильт­ рованием через асбестовые фильтры.

Для примера приводим рецепт одной из естественных питательных сред:

Среда для культивирования? клеток HeLa

 

Сыворотка ч ел овек а ...........................................................

50%

Куриный эмбриональный эк ст р а к т ..............................

2%

Раствор Х ен к са .....................................................................

48%>

Раньше естественные среды имели ш ирокое примене­ ние, но в настоящее время они уступили место другим типам сред — синтетическим и содержащ им фермента­ тивные гидролизаты белковы х веществ.

Среды, содержащие ферментативные гидролизаты

Чаще других применяют ферментативный гидролизат лакталъбумина, который получают из молока. Этот гид­ ролизат богат аминокислотами и витаминами. Для полу­ чения среды 0,5% гидролизата лактальбумина добавляют к раствору Хенкса. Кроме этого, среда обычно обогащ ает­ ся 2-10% , сыворотки. Среда содерж ит индикатор фенолрот и должна иметь оранжево-розовый цвет (pH 7,2). Срав­ нительно простая в изготовлении, данная среда заслуж и­

62 Общ а я медицинская вирусология

ла весьма вы сокую оценку вирусологов. В меньшей степе­ ни используют другие ферментативные гидролизаты — гидролизат казеина, гидролизат белков крови крупного рогатого скота (так называемый аминопептид-2).

Всем средам естественного происхож дения (в том чис­ ле с ферментативными гидролизатами) присущ общий недостаток — они не имеют строго определённого соста­ ва, что приводит иногда к неоднородным результатам и с­ следования.

Синт ет ические ср еды

Синтетические среды готовят из определённого набора химических вещ еств, поэтому они имеют постоянный и точно известный состав. Кроме того, они не содержат ж ивотного белка, что иногда бывает необходимо (напри­ мер, при изготовлении вакцины из культуры клеток, за­ ражённой вирусами).

Синтетические среды отличаются весьма сложным со ­ ставом. Чаще всего применяют среду 199 (Паркера), со ­ держащ ую 61 компонент и среду Игла, в состав которой входит около 30 компонентов.

Среда 199 ( П аркера) содержит 20 аминокислот, 17 ви­ таминов, пурины и пиримидины, глю козу, 9 минераль­ ных солей и ряд других веществ.

Эту среду готовят на солевом растворе Хенкса, стери­ лизуют фильтрованием через бактериальные фильтры. Среда 199 мож ет сохраняться на холоде до 6 месяцев.

Среда И гла содержит 13 незаменимых аминокислот, 4 катиона, 3 аниона, 6 витаминов, холин, инозит и угле­ воды. Вариантом этой среды является среда Дульбекко.

Имеются и другие синтетические среды.

На синтетических средах возмож но получение размно­ жения клеток без добавления биологических жидкостей. Однако в присутствии сыворотки рост культуры клеток значительно улучш ается. П оэтому в тех случаях, когда не требуется, чтобы среда была безбелковой, к синтети­ ческим средам, как правило, добавляют сыворотку.

Г лава 3 . М ето д ы исследования в вирусологии

63

В зависимости от содерж ания

питательных вещ еств

вирусологические среды принято подразделять на среды для размножения и среды поддерживающ ие.

Среды для размножения более богаты питательными вещ ествами в основном за счёт добавления 1 0 -20 % сы во­ ротки. Их используют для размножения клеток растущ ей культуры до заражения её вирусами, чтобы получить х о ­ роший рост.

Поддерживающие среды употребляют после зараж е­ ния культуры клеток вирусами, они содержат меньше пи­ тательных компонентов. Такие среды или совсем не со ­ держат сы воротки, или она добавляется в очень неболь­ шом количестве (2% ). Н еобходимо пользоваться прогретой при 56 °С сы вороткой, чтобы разруш ить антитела к куль­ тивируемому вирусу.

В настоящ ее время М осковский институт вирусны х препаратов М 3 РФ производит довольно ш ирокий ассор ­ тимент различных солевых растворов и вирсологических питательных сред (синтетических и с гидролизатом лактальбумина), которы ми снабж аю тся вирусологические лаборатории. Это избавляет их от излишней трудоёмкой работы по приготовлению питательных сред и растворов собственными силами и способствует стандартизации про­ водимых исследований.

Типы клеточных культур

Для приготовления культур клеток используют различ­ ные ткани ж ивотны х, человека и птиц как эмбриональ­ ные, так и зрелые. Кроме нормальных используют и зло­ качественно перерождённые ткани, получаемые из оп у­ холей.

И сточником эмбриональной ткани часто служит кури ­ ный зародыш , а также эмбрионы человека, мыш ей, сви ­ ней, кроликов и др. Эмбриональная и опухолевая ткани отличаются лучшей вы ж иваемостью и более активным ростом, чем ткани взрослого организма. Из зрелых тка­ ней чаще всего употребляется почечная ткань (обезьян,

6 4

Об щ а я медицинская вирусология

морских свинок, хомячков и др.), амниотическая оболоч­ ка человека.

Ткани следует брать по возмож ности в асептических условиях; в тех случаях, когда ткани инфицированы (на­ пример, миндалины, слизистая оболочка киш ечника), их обрабатывают большими дозами антибиотиков. Взятую ткань промывают в солевом растворе Хенкса и затем под­ вергают измельчению. Последующ ая обработка и культи­ вирование бы вают различными в зависимости от типа приготовления культуры .

Сущ ествуют культуры переж ивающ их тканей, в кото­ рых клетки временно сохраняют ж изнеспособность, но не размножаются, и культуры растущ их тканей, в которы х происходит активное размножение клеток.

В вирусологии используют только культуры растущих тканей, которы е подразделяют на:

1.Культуры фиксированных кусочков тканей.

2.Однослойные культуры клеток: а) первичные культуры клеток;

б) перевиваемые (стабильные) культуры клеток; в) культуры диплоидных клеток.

3.Культуры суспензированных клеток. См. график 1 (стр. 72) и график 2 (стр. 73).

Культуры фиксированных кусочков тканей (плазмированные культуры)

К усочки измельчённой ткани помещ ают в куриную плазму, образующ ую сгусток, в котором эти кусочки фик­ сируются. Поверх свернувшейся пламзы наливают ж ид­ кую фазу — раствор Хенкса (с антибиотиками) и эмбрио­ нальный экстракт. После 1 -2 дней инкубации вокруг к у ­ сочка начинают расти новые клетки на опорной сети из фибрина плазмы. В практической вирусологии эти куль­ туры не применяются, их вытеснили более удобные одно­ слойные культуры клеток. Однако на принципе культи­ вирования кусочков ткани основан современный метод органного культивирования. Органные культуры — это культуры, в которы х эмбрионы, зачатки органов, эксп ­ лантаты органов помещ ают в условия, обеспечивающие

Г лава 3 . М ето ды исследования в вирусологии

65

дифференцировку эмбриональной ткани, сохранение струк­ туры и (или) функции культивируемой культуры . Орган­ ные культуры выращ ивают на границе раздела ж идкой питательной и газовой фаз. И х используют в научно-ис­ следовательской работе, например, для изучения ответа ткани на вирусную инфекцию, патогенеза респираторных вирусных инфекций и др.

Однослойные культуры клеток

Однослойные культуры — это культуры, клетки кото­ рых растут и размножаются будучи прикреплёнными к твёрдому субстрату (стеклу, пластику), образуя слой тол­ щиной в одну клетку (монослой). Метод получения одно­ слойных культур клеток основан на обработке исходной ткани ферментами (обычно трипсином), разрушающими межклеточные связи; ткань диспергируется, и образуется взвесь изолированных клеток. При культивировании клет­ ки прикрепляются к стеклу сосуда (пробирки, матраца) и растут в виде сплошного монослоя, благодаря чему удобно воздействовать на клетки, заражая их вирусами, и визу­ ально наблюдать возникаю щ ие изменения в динамике. Однослойные культуры характеризуются однородностью, хорошей жизнеспособностью; мож но получать очень боль­ шие количества клеток. Таким образом, однослойные куль­ туры обладают целым рядом преимуществ, благодаря чему

инашли столь широкое применение в вирусологии.

а) Первичные культуры клеток

Однослойные культуры клеток называют первичными, если они способны размножаться только в первой генера­ ции, а их субкультуры удаётся получить далеко не все­ гда. П оэтому каждый раз для приготовления первичных культур клеток берут исходны й материал — эмбриональ­ ные или зрелые ткани ж ивотны х, птиц или человека.

Методика получения первичных культур фибробластов куриного эмбриона

1.Яйца, инкубированные 7 -11 дней, овоскопирую т. Убедившись в ж изнеспособности эмбриона, очер­ чивают границу воздуш ного мешка.

3 . Зак. 431

66

Общ а я медицинская вирусология

2.Скорлупу на тупом конце яйца протирают спир­ том, йодом, снова спиртом, а затем срезают на уров­ не воздуш ного мешка.

3.Извлекают эмбрион и помещ ают его в стерильную чаш ку, удаляют голову. Тело эмбриона обмывают 3—5 мл раствора Хенкса, который затем отсасывают.

4.Тело эмбриона тщательно измельчают ножницами, полученные кусочки (размером около 1 мм3) пи­ петкой переносят в пробирку.

5.П роводят 2 -3 -кратн ое отмывание измельчённой ткани от крови. Каждый раз наливают в пробирку с тканью по 2 -3 мл раствора, дают ткани осесть, после чего ж идкость отсасывают.

6.К отмы той ткани добавляют 3 мл 0,25% раствора трипсина и тщательно перемеш ивают содержимое пробирки с помощ ью «пипетирования» (многократ­ ного насасывания и выдувания ж идкости пипет­ кой) или энергичного встряхивания. Под действи­ ем трипсина клетки ткани разъединяются и обра­ зую т суспензию , поэтом у после оседания более крупны х тканевых частиц на дно пробирки ж ид­ кость над осадком должна остаться мутной.

7.Верхний помутневший слой ж идкости, содержащий взвесь изолированных клеток, переносят в центри­ фуж ную пробирку, куда заранее наливается 2,5 мл питательной среды гидролизата лактальбумина. Проводят центрифугирование при 1 ООО об/м ин в течение 1 0 -1 5 минут.

8.Надосадочную ж идкость удаляют, к осадку клеток добавляют 2 -3 мл гидролизата лактальбумина и тщательно перемешивают, чтобы клетки вновь ока­ зались во взвешенном состоянии. Для отделения конгломератов клеток, которы е могут попасть во взвесь, рекомендуется последующ ее фильтрование через сетку из нержавеющей стали или марлю.

9.П роизводится подсчёт клеток в камере Горяева под малым увеличением микроскопа. Определив кон-

68

Общ ая медицинская вирусология

перевиваемыми культурами менее трудоёмка: они, как правило, свободны от латентных вирусов; отличаются боль­ шим диапазоном чувствительности ко многим вирусам. Вирусологи различных стран могут пользоваться одними и теми же международными перевиваемыми клеточными линиями. Однако перевиваемые культуры не пригодны для производства вирусных вакцин, так как сущ ествую т опасения по поводу их возможной злокачественности.

Таблица 5

М еждународные линии культур клеток различного происхож дения

 

Из нормальных тканей

Из злокачественно

 

перерожденных тканей

 

 

 

Источник

 

название

 

название

 

орган-донор

линии

орган-донор

линии

 

 

клеток

 

клеток

1

2

3

4

5

 

 

WJSH

Рак шейки

HeLa

 

 

 

матки

 

 

Амнион

FL

Рак гортани

Нер-2

 

 

А-1, А-8

Назофаринге­

КВ

 

 

 

альный рак

 

Человек

Синовиальные

Me Соу

Лимфобластома

NC-37

 

клетки

 

 

 

 

Легкое

L-32

Лимфома

Raji

 

эмбриона

Буркита

 

 

 

 

Почки

КНЧанг

Рабдомио-

RD

 

эмбриона

саркома

 

Почки афри­

CV-1

 

 

 

канской зеле­

VERO

 

 

 

ной мартышки

GMK

 

 

Обезьяна

 

FRHK-4

 

 

 

Почки

LLC-MK-2

 

 

 

макаки-резус

МК-2

 

 

 

 

МА-104

 

 

 

 

 

 

Jac/c

 

 

 

Лимфома

FO

Мышь

Эмбрион

ЗТЗ

РЗ/01

Миелома

 

 

 

 

X 6 3 -A g 8

X N

Г лава 3 . М ето д ы исследования в вирусологии

 

69

 

 

 

Окончание табл. 5

1

2

3

4

5

Хомяк

Почки

ВНК21

 

 

СНО

 

 

 

 

 

 

Собака

Почки

MDCK

 

 

Кролик

Роговица

SJRC

 

 

 

Почки

PS

 

 

Свинья

JB-RS

 

 

 

 

СПЭВ

 

 

Перевиваемые культуры клеток без пересева на све­ ж ую среду довольно быстро дегенерируют (быстрее, чем первичные культуры ). При длительных пассажах их и с­ ходные свойства могут измениться. Для большей стабиль­ ности перевиваемых культур клеток рекомендуется пользо­ ваться клональными культурами (выделенными из од­ ной кл етки), с которы м и удаётся получить наиболее стандартные результаты опытов.

П оддерж ивание перевиваем ы х кул ьт ур клет ок в ла­ борат ории. Для этой цели исходную (маточную) культу­ ру клеток выращ ивают в матрацах с питательной средой, еженедельно пересевая культуру в новые сосуды . П овсед­ невные вирусологические исследования обычно проводят с культурами клеток в пробирках. При работе с проби­ рочными культурами также рекомендуется пересевать их через 7 -8 дней, или же раз в 3 -4 дня заменять питатель­ ную среду свеж ей, тогда клеточные культуры сохраняют свою ж изнеспособность 2 -3 недели.

Чтобы осущ ествить пересев перевиваемой культуры, необходимо отделить клеточный слой от стенки пробирки и получить клетки во взвешенном состоянии. Иногда это отделение проводят механическим путём — с помощ ью соскабливания пастеровской пипеткой; можно воздейство­ вать на клеточный пласт трипсином. Но чаще всего для этой цели применяют Версен (раствор натриевой соли эти- лен-диамино-тетра-уксусной кислоты), которы й связыва­ ет двухвалентные катионы магния и кальция. Эти ионы способствую т сохранению целостности пласта и прикреп­