Вирусология общая Горячкиной
.pdf60 |
Общ ая м едицинская вирусология |
Таблица 4
Состав солевых растворов (в г на л)
Вещества |
Раствор Хенкса |
|
Раствор Эрла |
|
NaCl |
|
8,0 |
|
6,8 |
КС1 |
|
0,4 |
|
0,4 |
CaCl, |
0,14 |
|
0,2 |
|
MgS04 х |
7Н20 |
0,1 |
п |
0,1 |
MgS04 х 6Н20 |
0,1 |
|
— |
|
NaH,P0„ х Н ,0 |
— |
|
0,125 |
|
N aH /O , х 2Н20 |
0,06 |
|
— |
|
KH..P0, |
0,06 |
|
— |
|
2 |
4 |
|
|
|
Глюкоза |
1,0 |
|
1,0 |
|
Фенолрот (не всегда) |
0,02 |
|
0,05 |
|
NaHC03 |
0,35 |
|
2,2 |
Вирусологические питательные среды
Питательные среды для клеточных культур в большин стве случаев готовят на основе солевых растворов. Разли чают:
1)естественные питательные среды (применяют редко);
2)ферментативные гидролизаты белковых веществ;
3)синтетические питательные среды.
Естественные питательные среды
Естественные питательные среды готовят на осн о ве солевых растворов Хенкса и Эрла, к которы м добавля ют сы воротку, амниотическую ж идкость, эмбриональный экстракт. Эти биологические ж идкости являются источ никами белкового питания, витаминов и других веществ, способствую щ их росту и размножению клеток.
Сыворотки (нативные или диализованные). Использу ют нормальные сыворотки человека, лошади, коров (луч ше телят), кур, кроликов и некоторые другие. Сыворотки должны храниться на холоде. Перед употреблением каж
Г лава 3 . М ето д ы исследования в вирусологии |
6 1 |
дая сы воротка должна быть проверена на отсутствие ток сичности для клеточных культур.
Амниотическую ж идкость обычно извлекают из к о ровьих маток (доставленных с бойни) с соблюдением асеп тики. Ж идкость сохраняется во флаконах с резиновыми пробками.
Эмбриональные экстракты чаще всего готовят из к у риных эмбрионов, обычно 9-11-дневного возраста. Тело эмбриона измельчают, добавляют равный объём раствора Хенкса, центрифугируют при 2000 -3000 об/мин в течение 30 минут. Полученная надосадочная жидкость и является эмбриональным экстрактом, который хранят в пробирках с резиновыми пробками в замороженном состоянии.
Все перечисленные биологические жидкости и экстрак ты в случае необходимости мож но стерилизовать фильт рованием через асбестовые фильтры.
Для примера приводим рецепт одной из естественных питательных сред:
Среда для культивирования? клеток HeLa |
|
Сыворотка ч ел овек а ........................................................... |
50% |
Куриный эмбриональный эк ст р а к т .............................. |
2% |
Раствор Х ен к са ..................................................................... |
48%> |
Раньше естественные среды имели ш ирокое примене ние, но в настоящее время они уступили место другим типам сред — синтетическим и содержащ им фермента тивные гидролизаты белковы х веществ.
Среды, содержащие ферментативные гидролизаты
Чаще других применяют ферментативный гидролизат лакталъбумина, который получают из молока. Этот гид ролизат богат аминокислотами и витаминами. Для полу чения среды 0,5% гидролизата лактальбумина добавляют к раствору Хенкса. Кроме этого, среда обычно обогащ ает ся 2-10% , сыворотки. Среда содерж ит индикатор фенолрот и должна иметь оранжево-розовый цвет (pH 7,2). Срав нительно простая в изготовлении, данная среда заслуж и
62 Общ а я медицинская вирусология
ла весьма вы сокую оценку вирусологов. В меньшей степе ни используют другие ферментативные гидролизаты — гидролизат казеина, гидролизат белков крови крупного рогатого скота (так называемый аминопептид-2).
Всем средам естественного происхож дения (в том чис ле с ферментативными гидролизатами) присущ общий недостаток — они не имеют строго определённого соста ва, что приводит иногда к неоднородным результатам и с следования.
Синт ет ические ср еды
Синтетические среды готовят из определённого набора химических вещ еств, поэтому они имеют постоянный и точно известный состав. Кроме того, они не содержат ж ивотного белка, что иногда бывает необходимо (напри мер, при изготовлении вакцины из культуры клеток, за ражённой вирусами).
Синтетические среды отличаются весьма сложным со ставом. Чаще всего применяют среду 199 (Паркера), со держащ ую 61 компонент и среду Игла, в состав которой входит около 30 компонентов.
Среда 199 ( П аркера) содержит 20 аминокислот, 17 ви таминов, пурины и пиримидины, глю козу, 9 минераль ных солей и ряд других веществ.
Эту среду готовят на солевом растворе Хенкса, стери лизуют фильтрованием через бактериальные фильтры. Среда 199 мож ет сохраняться на холоде до 6 месяцев.
Среда И гла содержит 13 незаменимых аминокислот, 4 катиона, 3 аниона, 6 витаминов, холин, инозит и угле воды. Вариантом этой среды является среда Дульбекко.
Имеются и другие синтетические среды.
На синтетических средах возмож но получение размно жения клеток без добавления биологических жидкостей. Однако в присутствии сыворотки рост культуры клеток значительно улучш ается. П оэтому в тех случаях, когда не требуется, чтобы среда была безбелковой, к синтети ческим средам, как правило, добавляют сыворотку.
Г лава 3 . М ето д ы исследования в вирусологии |
63 |
В зависимости от содерж ания |
питательных вещ еств |
вирусологические среды принято подразделять на среды для размножения и среды поддерживающ ие.
Среды для размножения более богаты питательными вещ ествами в основном за счёт добавления 1 0 -20 % сы во ротки. Их используют для размножения клеток растущ ей культуры до заражения её вирусами, чтобы получить х о роший рост.
Поддерживающие среды употребляют после зараж е ния культуры клеток вирусами, они содержат меньше пи тательных компонентов. Такие среды или совсем не со держат сы воротки, или она добавляется в очень неболь шом количестве (2% ). Н еобходимо пользоваться прогретой при 56 °С сы вороткой, чтобы разруш ить антитела к куль тивируемому вирусу.
В настоящ ее время М осковский институт вирусны х препаратов М 3 РФ производит довольно ш ирокий ассор тимент различных солевых растворов и вирсологических питательных сред (синтетических и с гидролизатом лактальбумина), которы ми снабж аю тся вирусологические лаборатории. Это избавляет их от излишней трудоёмкой работы по приготовлению питательных сред и растворов собственными силами и способствует стандартизации про водимых исследований.
Типы клеточных культур
Для приготовления культур клеток используют различ ные ткани ж ивотны х, человека и птиц как эмбриональ ные, так и зрелые. Кроме нормальных используют и зло качественно перерождённые ткани, получаемые из оп у холей.
И сточником эмбриональной ткани часто служит кури ный зародыш , а также эмбрионы человека, мыш ей, сви ней, кроликов и др. Эмбриональная и опухолевая ткани отличаются лучшей вы ж иваемостью и более активным ростом, чем ткани взрослого организма. Из зрелых тка ней чаще всего употребляется почечная ткань (обезьян,
6 4 |
Об щ а я медицинская вирусология |
морских свинок, хомячков и др.), амниотическая оболоч ка человека.
Ткани следует брать по возмож ности в асептических условиях; в тех случаях, когда ткани инфицированы (на пример, миндалины, слизистая оболочка киш ечника), их обрабатывают большими дозами антибиотиков. Взятую ткань промывают в солевом растворе Хенкса и затем под вергают измельчению. Последующ ая обработка и культи вирование бы вают различными в зависимости от типа приготовления культуры .
Сущ ествуют культуры переж ивающ их тканей, в кото рых клетки временно сохраняют ж изнеспособность, но не размножаются, и культуры растущ их тканей, в которы х происходит активное размножение клеток.
В вирусологии используют только культуры растущих тканей, которы е подразделяют на:
1.Культуры фиксированных кусочков тканей.
2.Однослойные культуры клеток: а) первичные культуры клеток;
б) перевиваемые (стабильные) культуры клеток; в) культуры диплоидных клеток.
3.Культуры суспензированных клеток. См. график 1 (стр. 72) и график 2 (стр. 73).
Культуры фиксированных кусочков тканей (плазмированные культуры)
К усочки измельчённой ткани помещ ают в куриную плазму, образующ ую сгусток, в котором эти кусочки фик сируются. Поверх свернувшейся пламзы наливают ж ид кую фазу — раствор Хенкса (с антибиотиками) и эмбрио нальный экстракт. После 1 -2 дней инкубации вокруг к у сочка начинают расти новые клетки на опорной сети из фибрина плазмы. В практической вирусологии эти куль туры не применяются, их вытеснили более удобные одно слойные культуры клеток. Однако на принципе культи вирования кусочков ткани основан современный метод органного культивирования. Органные культуры — это культуры, в которы х эмбрионы, зачатки органов, эксп лантаты органов помещ ают в условия, обеспечивающие
Г лава 3 . М ето ды исследования в вирусологии |
65 |
дифференцировку эмбриональной ткани, сохранение струк туры и (или) функции культивируемой культуры . Орган ные культуры выращ ивают на границе раздела ж идкой питательной и газовой фаз. И х используют в научно-ис следовательской работе, например, для изучения ответа ткани на вирусную инфекцию, патогенеза респираторных вирусных инфекций и др.
Однослойные культуры клеток
Однослойные культуры — это культуры, клетки кото рых растут и размножаются будучи прикреплёнными к твёрдому субстрату (стеклу, пластику), образуя слой тол щиной в одну клетку (монослой). Метод получения одно слойных культур клеток основан на обработке исходной ткани ферментами (обычно трипсином), разрушающими межклеточные связи; ткань диспергируется, и образуется взвесь изолированных клеток. При культивировании клет ки прикрепляются к стеклу сосуда (пробирки, матраца) и растут в виде сплошного монослоя, благодаря чему удобно воздействовать на клетки, заражая их вирусами, и визу ально наблюдать возникаю щ ие изменения в динамике. Однослойные культуры характеризуются однородностью, хорошей жизнеспособностью; мож но получать очень боль шие количества клеток. Таким образом, однослойные куль туры обладают целым рядом преимуществ, благодаря чему
инашли столь широкое применение в вирусологии.
а) Первичные культуры клеток
Однослойные культуры клеток называют первичными, если они способны размножаться только в первой генера ции, а их субкультуры удаётся получить далеко не все гда. П оэтому каждый раз для приготовления первичных культур клеток берут исходны й материал — эмбриональ ные или зрелые ткани ж ивотны х, птиц или человека.
Методика получения первичных культур фибробластов куриного эмбриона
1.Яйца, инкубированные 7 -11 дней, овоскопирую т. Убедившись в ж изнеспособности эмбриона, очер чивают границу воздуш ного мешка.
3 . Зак. 431
66 |
Общ а я медицинская вирусология |
2.Скорлупу на тупом конце яйца протирают спир том, йодом, снова спиртом, а затем срезают на уров не воздуш ного мешка.
3.Извлекают эмбрион и помещ ают его в стерильную чаш ку, удаляют голову. Тело эмбриона обмывают 3—5 мл раствора Хенкса, который затем отсасывают.
4.Тело эмбриона тщательно измельчают ножницами, полученные кусочки (размером около 1 мм3) пи петкой переносят в пробирку.
5.П роводят 2 -3 -кратн ое отмывание измельчённой ткани от крови. Каждый раз наливают в пробирку с тканью по 2 -3 мл раствора, дают ткани осесть, после чего ж идкость отсасывают.
6.К отмы той ткани добавляют 3 мл 0,25% раствора трипсина и тщательно перемеш ивают содержимое пробирки с помощ ью «пипетирования» (многократ ного насасывания и выдувания ж идкости пипет кой) или энергичного встряхивания. Под действи ем трипсина клетки ткани разъединяются и обра зую т суспензию , поэтом у после оседания более крупны х тканевых частиц на дно пробирки ж ид кость над осадком должна остаться мутной.
7.Верхний помутневший слой ж идкости, содержащий взвесь изолированных клеток, переносят в центри фуж ную пробирку, куда заранее наливается 2,5 мл питательной среды гидролизата лактальбумина. Проводят центрифугирование при 1 ООО об/м ин в течение 1 0 -1 5 минут.
8.Надосадочную ж идкость удаляют, к осадку клеток добавляют 2 -3 мл гидролизата лактальбумина и тщательно перемешивают, чтобы клетки вновь ока зались во взвешенном состоянии. Для отделения конгломератов клеток, которы е могут попасть во взвесь, рекомендуется последующ ее фильтрование через сетку из нержавеющей стали или марлю.
9.П роизводится подсчёт клеток в камере Горяева под малым увеличением микроскопа. Определив кон-
68 |
Общ ая медицинская вирусология |
перевиваемыми культурами менее трудоёмка: они, как правило, свободны от латентных вирусов; отличаются боль шим диапазоном чувствительности ко многим вирусам. Вирусологи различных стран могут пользоваться одними и теми же международными перевиваемыми клеточными линиями. Однако перевиваемые культуры не пригодны для производства вирусных вакцин, так как сущ ествую т опасения по поводу их возможной злокачественности.
Таблица 5
М еждународные линии культур клеток различного происхож дения
|
Из нормальных тканей |
Из злокачественно |
|||
|
перерожденных тканей |
||||
|
|
|
|||
Источник |
|
название |
|
название |
|
|
орган-донор |
линии |
орган-донор |
линии |
|
|
|
клеток |
|
клеток |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
|
|
WJSH |
Рак шейки |
HeLa |
|
|
|
|
матки |
|
|
|
Амнион |
FL |
Рак гортани |
Нер-2 |
|
|
|
А-1, А-8 |
Назофаринге |
КВ |
|
|
|
|
альный рак |
|
|
Человек |
Синовиальные |
Me Соу |
Лимфобластома |
NC-37 |
|
|
клетки |
|
|
|
|
|
Легкое |
L-32 |
Лимфома |
Raji |
|
|
эмбриона |
Буркита |
|||
|
|
|
|||
|
Почки |
КНЧанг |
Рабдомио- |
RD |
|
|
эмбриона |
саркома |
|||
|
Почки афри |
CV-1 |
|
|
|
|
канской зеле |
VERO |
|
|
|
|
ной мартышки |
GMK |
|
|
|
Обезьяна |
|
FRHK-4 |
|
|
|
|
Почки |
LLC-MK-2 |
|
|
|
|
макаки-резус |
МК-2 |
|
|
|
|
|
МА-104 |
|
|
|
|
|
|
|
Jac/c |
|
|
|
|
Лимфома |
FO |
|
Мышь |
Эмбрион |
ЗТЗ |
РЗ/01 |
||
Миелома |
|||||
|
|
|
|
X 6 3 -A g 8 |
X N
Г лава 3 . М ето д ы исследования в вирусологии |
|
69 |
||
|
|
|
Окончание табл. 5 |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
Хомяк |
Почки |
ВНК21 |
|
|
СНО |
|
|
||
|
|
|
|
|
Собака |
Почки |
MDCK |
|
|
Кролик |
Роговица |
SJRC |
|
|
|
Почки |
PS |
|
|
Свинья |
JB-RS |
|
|
|
|
|
СПЭВ |
|
|
Перевиваемые культуры клеток без пересева на све ж ую среду довольно быстро дегенерируют (быстрее, чем первичные культуры ). При длительных пассажах их и с ходные свойства могут измениться. Для большей стабиль ности перевиваемых культур клеток рекомендуется пользо ваться клональными культурами (выделенными из од ной кл етки), с которы м и удаётся получить наиболее стандартные результаты опытов.
П оддерж ивание перевиваем ы х кул ьт ур клет ок в ла борат ории. Для этой цели исходную (маточную) культу ру клеток выращ ивают в матрацах с питательной средой, еженедельно пересевая культуру в новые сосуды . П овсед невные вирусологические исследования обычно проводят с культурами клеток в пробирках. При работе с проби рочными культурами также рекомендуется пересевать их через 7 -8 дней, или же раз в 3 -4 дня заменять питатель ную среду свеж ей, тогда клеточные культуры сохраняют свою ж изнеспособность 2 -3 недели.
Чтобы осущ ествить пересев перевиваемой культуры, необходимо отделить клеточный слой от стенки пробирки и получить клетки во взвешенном состоянии. Иногда это отделение проводят механическим путём — с помощ ью соскабливания пастеровской пипеткой; можно воздейство вать на клеточный пласт трипсином. Но чаще всего для этой цели применяют Версен (раствор натриевой соли эти- лен-диамино-тетра-уксусной кислоты), которы й связыва ет двухвалентные катионы магния и кальция. Эти ионы способствую т сохранению целостности пласта и прикреп