БИОХИМИЯ

Какое значение имеет определение карбоксильных групп методом формолового титрования?

Каков принцип и химизм формолового титрования?

Как различаются белки по форме их молекул?

Что понимают под первичной структурой белка? Какие связи формируют эту структуру?

Что представляет собой вторичная структура белка? Какие связи ее формируют?

Что такое водородная связь?

Что понимают под третичной структурой белка? Какие связи формируют эту структуру?

Чем различаются структуры молекул глобулярных и фибриллярных белков?

Что понимают под четвертичной структурой белка?

Какими методами изучают структуру белковой молекулы?

31

Тема 5

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ

Хроматографические методы применяются для сорбционно-динамического разделения смеси аминокислот, белков (а также углеводов, липидов и их метаболитов).

Различают несколько видов хроматографии:

1) адсорбционная – основана на различной способности отдельных компонентов смеси адсорбироваться на поверхности твердой фазы сорбента

(М.С. Цвет, 1903 г.);

2)распределительная – основана на различной растворимости разделяемых веществ в двух малосмешивающихся жидкостях;

3)ионообменная – основана на различной способности разделяемых веществ к обмену их ионов на ионы неподвижной фазы сорбента;

4)осадочная – основана на образовании труднорастворимых осадков в определенной последовательности;

5)диффузионная – основана на разделении веществ по скорости диффузии внутрь сорбента в зависимости от размера молекул.

Различают хроматографические методы и по технике выполнения:

колоночная и плоскостная. В зависимости от агрегатного состояния фаз:

газовая, жидкостная и газожидкостная хроматография. По направлению движения растворителя: восходящая, нисходящая, одномерная, двумерная и радиальная.

32

Лабораторная работа №11

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ НА

БУМАГЕ

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

С помощью хроматографии можно выделить отдельные вещества из небольшого количества сложной смеси.

Отдельные аминокислоты обладают различной растворимостью в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которых является вода, а

другой – водонасыщенный органический растворитель, например фенол. Из них один растворитель должен быть полярный (неподвижная фаза), а другой – неполярный (подвижная фаза). Более гидрофобные аминокислоты, лучше растворяющиеся в неполярном растворителе, движутся с большей скоростью от линии старта, чем гидрофильные аминокислоты. В результате этого смесь аминокислот по окончании хроматографического разделения оказывается на разном расстоянии от линии старта.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) растворы аминокислот; 2) смесь бутанола, уксусной кислоты и воды

(15:3:7) или водонасыщенный раствор фенола; 3) нингидрин, 0,2 % спиртовой раствор; 4) вертикальные хроматографические камеры; 5) полоски хроматографической бумаги (длина 20-30 см, ширина 10-12 см); 6) капилляры для нанесения аминокислот; 7) пинцеты; 8) сушильный шкаф, нагретый до 7090 ºС; 9) линейка с делениями.

ХОД РАБОТЫ:

На полоске хроматографической бумаги простым карандашом проводят стартовую линию на расстоянии 2-3 см от нижнего края. В точки 1,2,3 (обозначенные карандашом на расстоянии 2 см друг от друга) наносят специальной пипеткой (или стеклянным капилляром) аминокислоты: в точку 1 -

триптофан (аланин или аргинин), в точку 2 - глицин (аргинин или лизин), в

точку 3 - их смесь. Нанесение проводят в несколько приемов, следя за тем,

33

чтобы пятно раствора при каждом прикосновении капилляра к бумаге не растекалось более чем на 3 мм. Каждую последующую порцию раствора наносят после полного высыхания предыдущей. Диаметр пятна не должен превышать 5 мм. Расстояние точек от бокового края хроматографической бумаги должно быть не менее 2 см. Полоску бумаги следует держать за края (!)

Полоску хроматографической бумаги с нанесенными на нее растворами

(после высушивания) помещают в хроматографическую камеру, в которую предварительно (за сутки) налита разделительная система бутанола, уксусной кислоты и воды (15:3:7) или водонасыщенный фенол. Нижний край хроматограммы погружают в жидкость примерно на 3-5 мм и подвешивают в камере, которую затем закрывают.

После достижения фронтом растворителя (водной смеси, бутанола и уксусной кислоты или фенола) верхнего конца бумаги (1-1,5 часа), полоску просушивают в сушильном шкафу, предварительно отметив границу фронта растворителя. После этого опускают её в 0,2 % спиртовой раствор нингидрина на 3 секунды. Затем просушивают в сушильном шкафу при температуре 70-90

ºС (15 минут). Позиции аминокислот на хроматограмме выявляются в виде сине-фиолетовых пятен.

Вклейте хроматограмму в тетрадь. Идентифицируйте пятна, рассчитав для каждого пятна коэффициент распределения Rf или скорость перемещения по формуле:

Rf = а/ b,

где а – расстояние в мм, пройденное аминокислотой от места нанесения аминокислоты до середины ее пятна; b – расстояние в мм от места нанесения аминокислоты до фронта растворителя.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОД:

34

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:

В чем принцип метода хроматографии?

Перечислите методы хроматографического разделения аминокислот?

Как проводится восходящая хроматография на бумаге?

Какие системы растворителей используются для распределительной хроматографии на бумаге?

Какая цветная реакция лежит в основе хроматографического выявления аминокислот на бумаге?

Объясните принцип разделения аминокислот методом тонкослойной ионообменной хроматографии?

В чем состоит принцип метода электрофореза?

35

Раздел 2. ФЕРМЕНТЫ

Тема 6

ФЕРМЕНТЫ КАК БИОЛОГИЧЕСКИЕ КАТАЛИЗАТОРЫ. СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ

Ферменты – биологические катализаторы белковой природы.

Синтезируются в клетках организма. Ферменты относятся к простым или сложным белкам. В молекуле одних ферментов – протеидов – белковая часть и простетическая группа слабо связаны между собой, в молекуле других,

наоборот, их связь прочная.

Высокая каталитическая активность ферментов связана с тем, что они временно соединяются с субстратом, образуя фермент-субстратные комплексы.

Часть ферментативного белка, взаимодействующая с субстратом называется активным центром фермента. Часть полипептидной цепи фермента, которая способствует определенному пространственному расположению активного центра, называется аллостерическим участком.

Благодаря своей белковой природе ферменты сохраняют все свойства белков. Денатурированные ферменты теряют свои специфические свойства биокатализаторов. С белковой природой связаны основные свойства ферментов

– специфичность, термолабильность, зависимость их действия от значения рН,

подверженность влиянию активаторов и ингибиторов.

Лабораторная работа №12

СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

Ферменты специфичны в отношение как типа катализируемых реакций,

так и субстратов, на которые они воздействуют. Некоторые ферменты обладают абсолютной специфичностью, действуют на один какой-либо

36

субстрат. Высокая специфичность ферментов определяется тем, что только некоторые, строго определенные функциональные группы, входящие в состав ферментов, могут участвовать в образовании фермент-субстратных комплексов. Аминокислоты, составляющие активный центр фермента, имеют определенное пространственное расположение, способствующее соединению с субстратом.

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Амилаза слюны ускоряет гидролиз только полисахаридов, не оказывая действия на дисахариды. Мальтаза слюны ускоряет гидролиз мальтозы,

образующейся при гидролизе крахмала, но не оказывает никакого действия на сахарозу.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) слюна в разведении 1:5; 2) сахароза, 1 %; 3) крахмал, 1 %; 4) NaOH, 10 %; 5) CuSO4, 1 %; 6) термостат или водяная баня (температура 38 оС); 7)

химический цилиндр на 10 мл.

ХОД РАБОТЫ:

В две пробирки приливают по 5 капель слюны, разведенной 1:5.

1.В первую пробирку добавляют 10 капель 1 % раствора крахмала.

2.Во вторую пробирку добавляют 10 капель 1 % раствора сахарозы.

Пробирки помещают на 10 мин в термостат или водяную баню при 38 оС.

Проделывают реакцию Троммера: к 5 каплям исследуемой жидкости прибавляют 5 капель 10 % раствора NaOH и 5 капель 1 % раствора сернокислой меди, нагревают. В присутствии глюкозы и мальтозы выпадает желтый осадок гидрата закиси меди или красный осадок закиси меди.

Результат занести в таблицу 6.

37

В четыре чистые пронумерованные пробирки приливают по 10 капель 1 %

раствора крахмала.

В пробирку №1 и в пробирку №2 добавляют по 10 капель слюны, разведенной 1:5. В пробирку №3 добавляют 10 капель прокипяченной слюны. В пробирку №4 (контрольная) добавляют 10 капель дистиллированной воды.

Пробирку №1 помещают на 10 минут в термостат или водяную баню при

38оС.

Пробирку №2 помещают на 10 минут в стакан со льдом.

Пробирки №3 и №4 оставляют на 10 минут при комнатной температуре. Затем с содержимым каждой пробирки проделывают качественные

реакции на крахмал (реакция с йодом) и продукты его расщепления (реакция Троммера), для чего содержимое каждой пробирки делят на две части.

Реакция на крахмал: к 5 каплям исследуемого раствора приливают 1 каплю раствора йода в йодистом калии. В присутствии крахмала появляется синее окрашивание.

Реакция Троммера: к 5 каплям исследуемой жидкости прибавляют 5 капель 10 % раствора NaOH и 5 капель 1 % раствора CuSO4, нагревают. В присутствии глюкозы и мальтозы выпадает желтый осадок гидрата закиси меди или красный осадок закиси меди.

Результаты занести в таблицу 7. Сделать вывод об оптимальной температуре для действия исследуемого фермента.

39

Лабораторная работа №14

ВЛИЯНИЕ РЕАКЦИИ СРЕДЫ НА ДЕЙСТВИЕ ФЕРМЕНТОВ СЛЮНЫ

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Каждый фермент наиболее активен в пределах довольно узкой зоны рН

(оптимум рН). При изменении рН в любую сторону от оптимального значения активность фермента уменьшается. Отклонение рН от оптимума может нарушать связь между белковой частью ферментов и их простетическими группами, может влиять на связывание субстрата с ферментов. Оптимум рН для амилазы слюны равен 6,9.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) слюна в разведении 1:100 (1:50); 2) крахмал, 0,5 % раствор; 3) Na2HPO4, 0,2 М раствор; 4) лимонная кислота, 0,1 М раствор; 5) раствор 0,1 % йода в 0,2 % йодистом калии; 6) NaCl, 1 % раствор; 7) микробюретки; 8) водяная баня или термостат (температура 38о); 9) пипетки на 1 мл.

ХОД РАБОТЫ:

В 7 пронумерованных пробирок наливают 0,2 М раствор Na2HPO4 и 0,1 М

раствор лимонной кислоты в соотношениях, указанных в таблице 9. Получают буферные растворы с рН от 5,6 до 8,0. В каждую пробирку добавляют по 10

капель 1 % раствора NaCl и 0,5 % раствора крахмала, по 10 капель слюны,

разведенной в 50 или 100 раз (согласно таблице 8).

40