БИОХИМИЯ

Содержимое пробирок перемешивают и помещают их в водяную баню или термостат при температуре 38о на 8 минут.

Затем во все пробирки добавляют по 1 капле раствора йода в йодистом калии, перемешивают, наблюдают окраску и определяют рН, при котором амилаза действует наиболее активно (оптимальную рН).

Результат занести в таблицу 9. Сделать вывод об оптимуме рН действия амилазы слюны.

Таблица 9

41

Лабораторная работа №15

ВЛИЯНИЕ АКТИВАТОРОВ И ИНГИБИТОРОВ

НА ДЕЙСТВИЕ ФЕРМЕНТОВ

Вещества, усиливающие действие ферментов, называются активаторами.

Активаторы стимулируют действие ферментов, но в отличие от коферментов не принимают участия в реакции.

Ингибиторами (парализаторами) называются вещества, снижающие скорость ферментативных реакций. Ингибирование действия ферментов может происходить в том случае, если с активным центром фермента вместо специфического субстрата соединяется близкий структурный аналог субстрата, т.е. вещество, близкое по строению к субстрату (конкурентное торможение). Ингибиторами нередко являются продукты промежуточных или конечных реакций какого-либо биохимического процесса.

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Активность амилазы слюны усиливается в присутствии хлористого натрия

– специфического активатора амилазы. Сернокислая медь оказывается тормозящее действие на активность амилазы. Крахмал и декстрины открывают реакцией с раствором йода.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) слюна в разведении 1:5; 2) крахмал, 1 %; 3) NaCl, 1 %; 4) CuSO4, 1 %; 5) 0,1 % раствора йода в 0,2 % йодистом калии; 6) пробирки.

ХОД РАБОТЫ:

В 3 пронумерованные пробирки приливают по 3 мл слюны, разведенной

1:5.

Впробирку №1 добавляют 2 капли 1 % раствора NaCl.

Впробирку №2 добавляют 2 капли 1 % раствора CuSO4.

Впробирку №3 (контрольная) добавляют 2 капли дистиллированной воды. Затем во все три пробирки приливают по 5 капель 1 % раствора крахмала.

42

Оставляют на 2 минуты при комнатной температуре. После чего проделывают реакцию на крахмал, приливая по 1 капле раствора йода в йодистом калии.

Результат занести в таблицу 10. Сделать вывод о том, какое из добавленных веществ является активатором, а какое – ингибитором.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:

При каких оптимальных условиях следует определять активность ферментов?

Как влияет рН на активность ферментов?

Как можно оценить специфичность ферментов?

Как можно воздействовать на скорость ферментативной реакции?

Как зависит скорость ферментативной реакции от концентрации субстрата?

Как влияют активаторы и ингибиторы на действие ферментов?

Конкурентные и неконкурентные ингибиторы. Механизм их действия.

Ингибиторы необратимого действия.

Регуляция активности ферментов. Единица активности.

Напишите уравнение реакции гидролиза крахмала до глюкозы под влиянием ферментов слюны.

Напишите уравнение химической реакции Троммера с глюкозой.

43

Тема 7

ДЕЙСТВИЕ ФЕРМЕНТОВ ОТДЕЛЬНЫХ КЛАССОВ

Катализируемая химическая реакция является тем признаком, по которому можно отличить один фермент от другого. Этот принцип был положен в основу классификации ферментов, согласно которой все известные ферменты

подразделяют на шесть классов.

 ЗАДАНИЕ: заполнить таблицу 11.

Лабораторная работа №16

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕПСИНА

Ферменты пищеварительного тракта, ускоряющие переваривание белков,

жиров и углеводов пищи, относятся к классу гидролаз. Ферменты,

принимающие участие в расщеплении белков в желудочно-кишечном тракте,

относятся к подклассу пептид-гидролаз. Особенностью пепсина является то,

что он максимально активен в резко кислой среде (оптимум рН 1,0-2,0).

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Створаживание молочно-ацетатной смеси при рН 4,9 и температуре 25 ºС

пепсином происходит в соответствии с его способностью переваривать белки.

За единицу активности пепсина принимают такое его количество, которое при

44

указанных условиях створаживает 5 мл молочно-ацетатной смеси за 1 мин (эта условная единица соответствует 0,01 мг кристаллического пепсина). В норме желудочный сок человека содержит в 1 мл 40-60 ед. пепсина.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) ацетатный буфер с рН 4,9; 2) молочно-ацетатная смесь; 3) раствор пепсина или желудочный сок; 4) пробирки, пипетки, секундомер.

ХОД РАБОТЫ:

Впробирку №1 помещают 1 мл желудочного сока (или раствора пепсина).

Впробирку №2 – 3 мл молочно-ацетатной смеси и прогревают 5 минут при

25 ºС. Затем быстро переливают молочно-ацетатную смесь в первую пробирку и включают секундомер. Как только на стенках пробирки появятся первые хлопья казеина, останавливают секундомер. Для расчета активности пепсина в 1 мл число 60 делят на количество секунд – получают количество единиц пепсина в 1 мл желудочного сока.

Например, 40 ед. соответствует 0,4 мг кристаллического пепсина. Результат занести в таблицу 12.

Лабораторная работа №17

ДЕЙСТВИЕ ПЕПСИНА НА БЕЛОК ФИБРИН

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Протеолитическую активность пепсина наблюдают, добавив к его подкисленному раствору небольшое количество фибрина. Фибрин,

45

нерастворимый в воде, под действием пепсина гидролизуется до растворимых в воде пептидов.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) 1 % раствор препарата пепсина в 0,2 % растворе HCl; 2) фибрин; 3) водяная баня; 4) пробирки; 5) пипетки; 5) термометр.

ХОД РАБОТЫ:

В пробирку №1 приливают 15 капель или 0,5 мл раствора пепсина, в пробирку №2 – такое же количество предварительно прокипяченного раствора пепсина. В каждую пробирку опускают небольшой кусочек фибрина. Обе пробирки помещают в водяную баню при температуре 38 оС на 60 минут. Наблюдают растворение фибрина.

Результаты занести в таблицу 13.

Таблица 13

Лабораторная работа №18

ОБНАРУЖЕНИЕ КАТАЛАЗЫ В КРОВИ

По химической природе каталаза является геминферментом. Каталаза катализирует разложение перекиси водорода на молекулярный кислород и воду: 2Н2О2 → О2↑ + 2Н2О

Биологическая роль каталазы заключается в обезвреживании перекиси водорода, образующейся в организме во время течения окислительно-

восстановительных процессов. ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Об активности каталазы крови судят по бурному выделению пузырьков кислорода при добавлении перекиси водорода к капле крови.

46

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) кровь; 2) Н2О2, 1 % раствор; 3) штатив с пробирками; 4) капельницы.

ХОД РАБОТЫ:

В пробирку наливают 10-15 капель 1 % раствора Н2О2 и добавляют каплю крови. Жидкость вспенивается, так как происходит бурное выделение пузырьков кислорода.

Результат занести в таблицу 14.

Лабораторная работа №19

ДЕЙСТВИЕ ЛИПАЗЫ НА ЖИРЫ

Липаза ускоряет гидролиз нейтрального жира. У человека она содержится в небольшом количестве в желудке; главным же образом липаза входит в состав сока поджелудочной железы. Желудочная липаза может действовать только на предварительно эмульгированные жиры, например на жир молока.

В кишечнике желчные кислоты и белки способствуют эмульгированию липидов и тем самым активируют действие липазы поджелудочной железы.

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Липазу открывают, добавив ее раствор к молоку, подщелоченному раствором карбоната натрия до бледно-розовой окраски на фенолфталеин. В

присутствии липазы происходит гидролитическое расщепление жира молока на глицерин и жирные кислоты, реакция среды сдвигается в кислую сторону,

розовая окраска исчезает.

47

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) вытяжка из препарата поджелудочной железы или 5 % раствор панкреатина; 2) сухие сливки, 5 % раствор; 3) фенолфталеин, 1 % спиртовой раствор; 4) карбонат натрия, 1 % раствор; 5) бюретки; 6) пробирки; 7) пипетки;

8) водяная баня; 9) термометры. ХОД РАБОТЫ:

В 2 пронумерованные пробирки наливают по 10 капель 5 % раствора сухих сливок. В пробирку №1 добавляют 5 капель вытяжки из поджелудочной железы или раствор панкреатина, содержащий липазу. В пробирку №2 добавляют такое же количество воды. В обе пробирки приливают по 1 капле 1 % раствора фенолфталеина и по каплям 1 % раствор карбоната натрия до появления бледно-розовой окраски (нельзя добавлять избыток раствора карбоната натрия). Пробирки помещают в водяную баню или термостат при температуре 38 оС на 30 минут. Наблюдают изменение окраски.

Результаты занести в таблицу 15.

Таблица 15

исходная конечная

Лабораторная работа №20

ДЕЙСТВИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ КРОВИ

К пероксидазам относятся ферменты, катализирующие окисление субстрата с помощью перекиси водорода. От субстратов под действием пероксидазы переносятся электроны на перекись водорода. Образуется окисленный субстрат и вода.

48

Пероксидазы относятся к геминовым ферментам; с состав их

простетической группы входит гем.

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Об активности пероксидазы судят по изменению окраски бензидина.

Окисленный бензидин приобретает зеленую, синюю, постепенно переходящую в бурую окраску.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) кровь, разбавленная водой; 2) Н2О2, 3 % раствор; 3) бензидин, 1 %

раствор в ледяной уксусной кислоте; 4) штатив с пробирками; 5) капельницы.

ХОД РАБОТЫ:

В 2 пронумерованные пробирки наливают по 5 капель 1 % раствора

бензидина и по 5 капель 3 % раствора Н2О2. В пробирку №1 добавляют 5 капель разбавленной крови, в пробирку №2 – 5 капель воды. Наблюдают за изменением окраски.

Результаты занести в таблицу 16.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:

Классификация и номенклатура ферментов. Охарактеризуйте свойства ферментов.

Какие ферменты и как действуют на пептидные связи? До каких продуктов расщепляет пепсин белки? Ферменты, действующие на сложноэфирные связи.

49

Чем определяется ход ферментативных процессов и какое влияние оказывают продукты распада на эти процессы?

Какие ферменты активируют окисление веществ путем дегидрирования?

Какие вещества входят в состав коферментов дегидрогеназ?

50