БИОХИМИЯ

* Изомеры 5'-нуклеотидов, в которых фосфат связан с кислородом при С-

3', называют 3'-нуклеотидами.

Нуклеопротеиды – сложные белки, состоящие из простого белка и небелковой части – нуклеиновых кислот. Нуклеопротеиды содержатся в большом количестве в ядерном веществе клеток. Кроме того, они выделены из

цитоплазмы.

Нуклеопротеиды обладают свойствами кислот, нерастворимы в воде и растворимы в щелочах. Нуклеопротеиды содержат простой белок, в основном состоящий из протаминов или гистонов, которые обладают щелочными

свойствами за счет большого количества входящих в них

61

диаминомонокарбоновых кислот (аргинин, лизин и гистидин). Небелковая

часть нуклеопротеидов представлена нуклеиновыми кислотами.

Лабораторная работа №25

ВЫДЕЛЕНИЕ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОПРОТЕИДОВ (ДНП) ИЗ

ТКАНЕЙ

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Дезоксирибонуклеопротеиды растворяются в растворах солей средней концентрации (например, в 1 М хлориде натрия) с образованием вязких растворов и снова осаждаются при разведении их (0,15 М) в виде нитей нуклеопротеидов.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) NaCl, 2 М и 1 М растворы, содержащие 0,04 % трехзамещенного цитрата натрия (раствор хранят в холодильнике); 2) NaOH, 0,4 и 10 %; 3)

дифениламиновый реактив, 1 % (1 г дифениламина, дважды перекристаллизованного из 70 % спирта или петролейного эфира, растворяют в смеси 2,75 мл концентрированной серной кислоты и 100 мл ледяной уксусной кислоты); 4) CuSO4, 1 %; 5) селезенка, печень.

ХОД РАБОТЫ:

1.Экстракция и выделение ДНП из тканей.

1)В ступке, охлаждаемой льдом, растирают 2 г ткани органа, затем постепенно добавляют 5 мл охлажденного 2 М раствора хлорида натрия,

содержащего 0,04 % трехзамешенного цитрата натрия, и растирают в ступке еще в течение 15 мин.

2) Затем, перемешивая содержимое, постепенно, малыми порциями добавляют 50 мл охлажденного 1 М раствора хлорида натрия. Образовавшуюся гомогенную массу переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 15

мин при 3000 об/мин.

62

3)Надосадочную жидкость после центрифугирования сливают в маленький стакан, измеряют в цилиндре объем полученного центрифугата и медленно вливают его в шестикратный объем дистиллированной воды тонкой струйкой, размешивая жидкость деревянной палочкой. Выделившиеся нити ДНП наматывают на деревянную палочку. Затем часть нитей ДНП осторожно собирают и вместе с палочкой переносят в другую пробирку.

4)Нити выделенного ДНП растворяют в 1 мл 0,4 % раствора NaOH.

Полученный раствор делят на две части и ставят: 1) биуретовую реакцию (на

белок); 2) реакцию с дифениламином (на ДНК).

2. Качественная реакция на белковый компонент ДНП. К 5-10 каплям раствора ДНП добавляют 10 капель 10 % раствора NaOH и по 1 капле 1 %

раствора CuSO4. Раствор окрашивается в сине-фиолетовый цвет.

3. Качественная реакция на нуклеиновую кислоту в ДНП. При нагревании ДНП гидролизуются, а освободившаяся дезоксирибоза дает синее окрашивание. К раствору (15-20 капель) добавляют равный объем дифениламина, находящегося в смеси с уксусной и серной кислотами. Смесь нагревают на кипящей водяной бане 15 мин. Жидкость постепенно приобретает синюю окраску, обусловленную реакцией дифениламина с дезоксирибозой.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОД:

Лабораторная работа №26

ГИДРОЛИЗ НУКЛЕОПРОТЕИДОВ

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Для изучения состава нуклеопротеидов проводят кислотный гидролиз дрожжей в присутствии серной кислоты. При непродолжительном, т.е.

частичном, гидролизе нуклеопротеиды распадаются на белок и нуклеиновые кислоты. Про продолжительном гидролизе наступает полный распад нуклеопротеидов.

63

При гидролизе мононуклеотидов выделяются пуриновые или пиримидиновые основания, углевод (рибоза или дезоксирибоза) и фосфорная кислота.

Составные части нуклеопротеидов в гидролизате можно открыть с помощью цветных (качественных) реакций.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) Н2SO4, 10 %; конц.; 2) NaOH, 10 %; 3) CuSO4, 1 %; 4) аммиак концентрированный; 5) AgNO3, 2 % аммиачный раствор; 6) молибденовый реактив – раствор молибденовокислого аммония в азотной кислоте; 7) тимол, 1 % алкогольный раствор; 8) круглодонная колба с воздушным холодильником;

9) воронка с фильтром; 10) мерный цилиндр на 50 или 100 мл; 11) дрожжи

(пекарские).

ХОД РАБОТЫ:

1. Кислотный гидролиз нуклеопротеидов. Помещают 1 г пекарских дрожжей в круглодонную колбу на 100 мл, добавляют 20 мл 10 % раствора серной кислоты и 20 мл дистиллированной воды. Колбу закрывают пробкой с длинной стеклянной трубкой и кипятят под тягой в течение 1 часа на асбестовой сетке при слабом нагревании. Через час после начала кипения нагревание жидкости прекращают, дают ей остыть, переносят в цилиндр,

доводят водой до первоначального объема и фильтруют.

С фильтратом проделывают качественные реакции на составные части нуклеопротеидов. При гидролизе нуклеиновых кислот обнаруживаются фосфорная кислота, рибоза или дезоксирибоза и азотистые основания – пуриновые и пиримидиновые.

2. Качественные реакции на составные части нуклеопротеидов.

2.1. Биуретовая проба на полипептиды. К 5 каплям гидролизата прибавляют 10 капель 10 % раствора NaOH и 1 каплю 1 % раствора CuSO4.

Жидкость окрашивается в розовый цвет.

2.2. Серебряная проба на пуриновые основания. Нейтрализуют 10 капель гидролизата 1 каплей концентрированного аммиака и добавляют 5 капель 1 %

64

раствора AgNO3. При стоянии через 3-5 мин выпадает небольшой бурый осадок серебряных производных пуриновых оснований.

2.3. Качественная реакция Молиша на пентозную группировку. При взаимодействии концентрированной серной кислоты с гексозами или пентозами происходит дегидратация их: из пентоз образуется фурфурол, а из гексоз – оксиметилфурфурол. Они дают с тимолом (метилизопропилфенол) или

α-нафтолом в присутствии концентрированной серной кислоты продукты конденсации красного цвета.

К 10 каплям профильтрованного гидролизата дрожжей добавляют 2-3

капли 1 % алкогольного раствора тимола, перемешивают и по стенке пробирки осторожно (!) приливают 20 капель концентрированной Н2SO4.

При встряхивании на дне пробирки образуется красное окрашивание вследствие образования продукта конденсации фурфурола с тимолом.

2.4. Молибденовая проба на фосфорную кислоту. К 3-5 каплям гидролизата приливают 20 капель молибденового реактива (раствор молибденовокислого аммония в азотной кислоте) и кипятят несколько минут.

Жидкость окрашивается в лимонно-желтый цвет. При охлаждении образуется желтый кристаллический осадок комплексного соединения фосфорно-

молибденовокислого аммония.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОД:

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:

Химический состав нуклеиновых кислот.

Назовите особенности строения нуклеотидов ДНК и РНК.

Что такое минорные основания? Приведите примеры.

Какой состав имеют нуклеопротеиды.

При каких условиях проводится гидролиз нуклеопротеидов? Что является продуктами такого гидролиза? Как можно его контролировать?

Синтез пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов de novo.

65

Синтез нуклеотидов из готовых продуктов.

Распределение нуклеотидов в организме.

Циклические нуклеотиды.

Типы и распределение рибонуклеиновых кислот в клетке.

66

Раздел 4. УГЛЕВОДЫ И ИХ ОБМЕН

Тема 10

УГЛЕВОДЫ. ВОССТАНАВЛИВАЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ УГЛЕВОДОВ

Углеводы представляют собой полигидроксиальдегиды и полигидроксикетоны с общей формулой (СН2О)n.

В организме человека и животных они выполняют энергетическую,

защитную, структурную, механическую и другие функции. Так, глюкоза является ценнейшим питательным веществом для большинства клеток и особенно ткани мозга.

Все углеводы условно делят на две группы:

1. Углеводы с преимущественно энергетической функцией. Глюкоза при

полном окислении одной молекулы дает 38 молекул АТФ. Гомополисахариды

(крахмал – в растениях; гликоген – в животных клетках) состоят из остатков α- D-глюкозы. Откладываются в цитозоле в виде гранул и несут резервную функцию.

2.Углеводы с преимущественно структурной функцией. Гликопротеины

игликолипиды входят в состав мембран клеток и участвуют в специфических взаимодействиях (например, рецепторы). Гликозаминогликаны входят в состав соединительной ткани. Некоторые из них (гепарин) выполняют регуляторную функцию.

Классификация углеводов основана на их структуре и физико-химических свойствах.

67

 ЗАДАНИЕ: заполнить таблицу 22.

Таблица 22

Формулы

Восстанавливающая способность углеводов.

Врастворах сахаров можно обнаружить карбонильную группу, спиртовой

иполуацетальный гидроксилы. Каждая из этих групп вступает в реакции окисления-восстановления. Восстанавливающая способность моносахаридов характеризуется тем, что при действии слабых окислителей или ферментативно альдегидная группа в положении С1 переходит в карбоксильную.

У дисахаридов, обладающих восстанавливающей способностью, связь между мономерами осуществляется за счет спиртового и полуацетального гидроксилов. Одно из мономерных звеньев сохраняет свободный полуацетальный гидроксил, который определяет восстанавливающие свойства

ивсе реакции, свойственные моносахаридам.

У невосстанавливающих дисахаридов гликозидная связь образована за счет полуацетальных гидроксилов обоих моносахаридов. Поэтому они не проявляют характерных реакций альдегидной группы.

Лабораторная работа №27

КАЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Глюкоза – важнейшая в физиологическом отношении гексоза, является основным энергетическим субстратом организма. Главные источники глюкозы

– сахароза, крахмал, запасы гликогена в печени, а также реакции синтеза из

68

аминокислот, лактата.

Качественно глюкозу можно обнаружить с помощью реакции «серебряного зеркала». Благодаря восстанавливающей способности глюкозы бесцветный раствор гидрата окиси серебра восстанавливается до металлического серебра,

которое выделяется в виде черного осадка, либо в виде блестящего зеркального налета.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) AgNO3, 0,2 н; 2) NaOH, 2 н; 3) NH4OH, 2 н; 4) глюкоза, 0,5 %; 5)

дистиллированная вода; 6) пробирки, пипетки, держатели и спиртовки.

ХОД РАБОТЫ:

В пробирку наливают 3-4 капли 0,2 н раствора AgNO3; 5 капель 2 н

раствора NaOH и некоторое количество 2 н раствора NH4OH (по каплям до полного растворения образующегося осадка). Затем в пробирку добавляют 3-4

капли раствора глюкозы. Слегка подогревают на спиртовке. Наблюдают изменения.

В другой пробирке проделывают ту же реакцию с дистиллированной водой или раствором сравнения.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОД:

Лабораторная работа №28

КАЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФРУКТОЗЫ

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Из фруктозы под действием кислоты при нагревании образуется оксиметилфурфурол, который затем, конденсируясь с резорцином, дает красное окрашивание.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) фруктоза, 0,5 %; 2) глюкоза, 0,5 %; 3) реактив Селиванова (0,5 % раствор резорцина в 20 % соляной кислоте); 4) пробирки; 5) пипетки; 6) спиртовки и держатели.

69

ХОД РАБОТЫ:

Впробирку приливают 10 капель раствора фруктозы. Затем туда добавляют 10 капель реактива Селиванова и осторожно нагревают пробирку на спиртовке. Наблюдают развитие окрашивания.

Вдругой пробирке проделывают ту же реакцию с раствором глюкозы (или

сдистиллированной водой). Результат занести в таблицу 23.

Таблица 23

Наблюдаемое окрашивание

Лабораторная работа №29

ОБНАРУЖЕНИЕ ВОССТАНАВЛИВАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ

УГЛЕВОДОВ

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Углеводы, обладающие восстанавливающей способностью, способны восстанавливать не растворимый в воде осадок гидрата окиси меди в желтый, а затем в красный осадок закиси меди.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) глюкоза, 0,5 %; 2) NaOH, 2 н; 3) CuSO4, 0,2 н; 4) фруктоза, 0,5 %; 5)

сахароза, 0,5 %; 6) лактоза, 1 %; 7) крахмал, 1 %; 8) пробирки, пипетки; 9)

спиртовки и держатели. ХОД РАБОТЫ:

В 5 пронумерованных пробирок наливают по 0,5 мл растворов глюкозы (пробирка №1), фруктозы (пробирка №2), сахарозы (пробирка №3), лактозы (пробирка №4) и крахмала (пробирка №5). Затем в каждую пробирку добавляют по 6-8 капель 2 н раствора NaOH и небольшое количество 0,2 н раствора CuSO4 (по каплям пока не прекратится его растворение). Осторожно нагревают каждую пробирку на спиртовке.

Наблюдаемые изменения занести в таблицу 24. Сделать вывод о

70