БИОХИМИЯ

Раздел 7. ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН

Тема 15

ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН. ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ

Окислительное фосфорилирование – синтез АТФ из АДФ и неорганического фосфата, сопряженный с переносом протонов и электронов по дыхательной цепи от субстратов к кислороду. Осуществляется комплексом АТФ-синтазой во внутренней мембране митохондрий.

Лабораторная работа №41

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АТФ

И КРЕАТИНФОСФАТА В МЫШЦЕ

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

В мышечной ткани содержится два макроэргических соединения – АТФ и креатинфосфат, которые обеспечивают по мере надобности мышцу энергией.

Метод основан на том, что два последних остатка фосфорной кислоты в АТФ,

богатые энергией, как и фосфорный остаток в креатинфосфате, легко отщепляются при непродолжительном гидролизе в кислой среде – так называемый лабильно связанный фосфор. Сравнение содержания неорганического фосфора в пробах до и после гидролиза дает представление о количестве лабильно связанного фосфора, которое приходится на макроэргические соединения мышечной ткани. Количество фосфора определяют по цветной реакции с молибдатом аммония в присутствии аскорбиновой кислоты.

91

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1)мышечная ткань животного; 2) ТХУ, 2,5 %; 3) HCl, 1 М; 4) NaOH, 1 М;

5)молибдат аммония, 1 %; 6) аскорбиновая кислота, 1 %; 7) пробирки, пипетки;

8)ФЭК.

ХОД РАБОТЫ:

Мышцу (0,5 г) гомогенизируют во льду в 5 мл охлажденной 2,5 % ТХУ.

Фильтруют в мерную пробирку. Осадок на фильтре промывают 5 мл холодной дистиллированной воды. Объем доводят до 10 мл.

Смесь в пробирках перемешать, экспозиция 10 мин при комнатной температуре

Колориметрировать на ФЭКе против воды при 670 нм

В опытной пробе (после гидролиза) определяемый неорганический фосфор представляет собой сумму лабильно связанного фосфора и фосфатных солей,

присутствующих в тканях, в контрольной пробе – только фосфатные соли.

Вычитают из оптической плотности, найденной для опытной пробы,

оптическую плотность, полученную для контрольной пробы. Концентрацию

92

лабильно связанного неорганического фосфора в пробе находят по калибровочному графику.

Рассчитывают количество лабильно связанного фосфора, учитывая разведение:

Х=А х 3,3 х 400 х 1000,

где Х - содержание макроэргических соединений в пересчете на 1 мг АТФ в 1 кг сырой ткани; А – содержание АТФ в пробе, мг; 3,3 х 400 – коэффициент пересчета на 1 г ткани с учетом разведения растворов.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОДЫ:

Лабораторная работа №42

ОБНАРУЖЕНИЕ НАД В ДРОЖЖАХ

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

НАД встречается во многих органах и тканях человека и животных, богаты им и дрожжи. Этот кофермент легко извлекается из дрожжей горячей водой (он термостабилен) и может быть обнаружен по образованию флуорисцирующего комплекса с ацетоном. Эта реакция характерна для производных амида никотиновой кислоты.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) дрожжи; 2) ацетон; 3) раствор NaOH, 300 г/л; 4) HCl, конц.; 5) спиртовой раствор фенолфталеина, 5 г/л; 6) пробирки; 7) спиртовки; 8) держатели; 9)

водяная баня; 10) флуориметр.

ХОД РАБОТЫ:

В пробирку помещают кусочек дрожжей величиной 4-5 мм, добавляют 1/3

пробирки воды и кипятят 20-30 сек, не допуская выбрасывания жидкости.

Отфильтровывают в пустую пробирку 5-10 капель полученного экстракта,

добавляют 3-5 капель ацетона и 1-2 капли раствора едкого натра. Оставляют

93

пробирку на 2 минуты; затем добавляют 1 каплю раствора фенолфталеина и по каплям соляную кислоту до обесцвечивания фенолфталеина. Пробирку в процессе добавления кислоты встряхивают. Поместить пробирку на 2 минуты в кипящую баню, затем охладить и поднести к включенному флуориметру.

Ацетоновый комплекс НАД флуоресцирует синим светом.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОД:

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:

Напишите схему митохондриальной дыхательной цепи?

К какому классу веществ относятся цитохромы?

Роль железа, входящего в состав простетической группы цитохромов.

Окислительное фосфорилирование АДФ, его связь с тканевым дыханием.

Субстратное фосфорилирование АДФ, примеры.

Сколько молекул АТФ накапливается во время образования одной молекулы эндогенной воды?

Напишите реакции цикла трикарбоновых кислот Кребса.

Значение цикла трикарбоновых кислот Кребса.

94

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Комов В.П. Биохимия: учеб. для вузов / В.П. Комов, В.Н. Шведова.- М.:

Дрофа, 2004.- 638 с.

2.Ленинджер А. Основы биохимии: В 3-х т. - М.: Мир, 1985.- 368 с.

3.Филиппович Ю.Б. Основы биохимии: Учеб.- М.: Высш. шк., 1985.- 503 с.

4.Берёзов Т.Т. Биологическая химия: Учебник / Т.Т. Берёзов, Б.Ф.

Коровкин.- М.: Медицина, 1982.- 1-е издание; 1998.- 2-е издание; 2002.- 3-е

издание (704 с.)

5. Жеребцов Н.А. Биохимия: Учебник / Н.А. Жеребцов, Т.Н. Попова, В.Г.

Артюхов.- Воронеж: Изд-во Воронежского гос. ун-та, 2002.- 696 с.

6. Кнорре Д.Г. Биологическая химия: Учеб. для хим., биол. и мед. спец.

вузов / Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина.- М.: Высш. шк., 2003.- 479 с.

7.Николаев А.Я. Биологическая химия.- М.: Высш. шк., 1989; М.: ООО

Мединформагентство, 2001.

8.Уайт Л. с соавт. Основы биохимии.- М.: Мир, 1981. Т. 1,2.

9.Степанов В.М.. Молекулярная биология. Структура и функции белков.

1996.

10. Проскурина И.К. Биохимия: Учеб. пособие.- Изд-во ВЛАДОС-ПРЕСС,

2003.- 204с.

11. Зелди И.П. Методы экспериментальной биологии: Учеб. пособие / И.П.

Зелди, А.В. Смирнов, Л.Б. Киселева, В.Н. Самарцев / Под ред. И.П. Зелди.-

Йошкар-Ола: МарГУ, 2002.- 152 с.

12. Самарцев В.Н. Избранные главы биоэнергетики. Разобщение окислительного фосфорилирования: Учеб. пособие.- Йошкар-Ола: МарГУ,

2000.- 38 с.

13. Самарцев В.Н. Основы энзимологии: Практическое рук-во.- Йошкар-

Ола: МарГУ, 2001.- 30 с.

14. Практикум по биохимии: Учеб. пособие/ Под ред. С.Е. Северина, Г.А.

Соловьевой.- М.: Изд-во МГУ, 1989

95

15. Чиркин А.А. Практикум по биохимии: Учеб. пособие / А.А. Чиркин.-

Мн.: Новое знание, 2002.- 512 с.

16. Пустовалова Л.М. Практические работы по биохимии.- Ростов н/Д.:

Феникс, 2004.- 320 с.

17. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: В 2-х т. Т2.- Мн.: Беларусь, 2000.- 463 с.

18. Методы практической биохимии./Под ред. С.Е. Северина и А.Д.

Виноградова.- М.: Изд-во «Мир», 1978

19. Шарпенак А.Э., Конышев В.А. Практикум по биологической химии.-

М.: Высшая школа.

20. Кушманов О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к практическим занятиям по биологической химии.- М.: Медицина.

21. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /

Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др. /Под ред. В.В.

Меньшикова.- М.: Медицина, 1987.- 368 с.

22. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен). Учеб. пособие / Под ред. М.И. Прохоровой.- Л.: Изд-во Ленинградского ун-та, 1982

23. Комаров Ф.И., Коровкин Б.Ф., Меньшиков В.В. Биохимические исследования в клинике.- Элиста: АПП «Джангар», 1998.- 250 с.

96

СОДЕРЖАНИЕ

Ведение….……………………………………………………………………………2

Раздел 1. БЕЛКИ………………………………………………………………..........4

Тема 1. Аминокислотный состав белка. Классификация и свойства аминокислот. Качественные реакции на белки и аминокислоты………………...4

Тема 2. Физико-химические свойства белков. Методы осаждения белков.

Высаливание и денатурация……………………………………………………….13

Тема 3. Количественное определение белка. Оценка на основании фотометрии продуктов цветной реакции. Построение калибровочных

графиков…………………………………………………………………………….22

Тема 4. Гидролиз белка. Характеристика пептидной связи……………………..27

Тема 5. Хроматографическое разделение аминокислот…………………………32

Раздел 2. ФЕРМЕНТЫ………………………………….…………….……………36

Тема 6. Ферменты как биологические катализаторы. Свойства ферментов…...36

Тема 7. Действие ферментов отдельных классов………………………………...44

Тема 8. Витамины, как структурные компоненты ферментов…………………..51

Раздел 3. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И ИХ ОБМЕН………………………...59

Тема 9. Структура и функции нуклеиновых кислот. Нуклеопротеиды………...59

Раздел 4. УГЛЕВОДЫ И ИХ ОБМЕН…………………………………………….67

Тема 10. Углеводы. Восстанавливающая способность углеводов……………...67

Тема 11. Обмен углеводов…………………………………………………………72

Раздел 5. ЛИПИДЫ И ИХ ОБМЕН……………………………………………….77

Тема 12. Структура и функции липидов………………………………………….77

Тема 13. Обмен липидов…………………………………………………………...84

Раздел 6. ГОРМОНЫ……………………………………………………………….87

Тема 14. Регуляция обмена веществ. Гормоны…………………………………..87

Раздел 7. ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН………………………………………….91

Тема 15. Энергетический обмен. Окислительное фосфорилирование…………91

Список литературы…………………………………………………………………95

97