БИОХИМИЯ

наблюдают за развитием окрашивания, свойственного для реакции Паули.

Проделывают эту же реакцию с водой. Какая окраска?

Результаты занести в таблицу 2.

ВЫВОД:

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:

Что такое белок? Как связаны между собой аминокислоты в молекуле белка?

Назовите функции аминокислот. Охарактеризуйте структуру и общие свойства функциональных групп аминокислот.

Кислотно-основные свойства аминокислот. Какие химические реакции характерны для аминокислот?

Классификация аминокислот по свойствам радикалов.

Особенности оптической изомерии аминокислот. Сколько стереоизомеров имеют аминокислоты?

Что открывает нингидриновая реакция? Напишите уравнение реакции.

Что открывает биуретовая реакция? Напишите уравнение реакции.

Что открывает ксантопротеиновая реакция? Напишите уравнение реакции.

Напишите аминокислоты, содержащие серу. С помощью какой реакции можно их открыть?

11

С помощью какой реакции можно обнаружить аминокислоту гистидин в

белке?

Покажите образование пептидной связи на примере любого трипептида.

Охарактеризуйте особенности и свойства пептидной связи.

12

Тема 2

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ. МЕТОДЫ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ. ВЫСАЛИВАНИЕ И ДЕНАТУРАЦИЯ

Белки образуют коллоидные растворы (размеры частиц - 0,1-0,001 мкм),

для которых важны следующие характеристики: низкое осмотическое давление,

высокая вязкость, низкая способность к диффузии.

Коллоидные свойства белков характеризуют способность белков образовывать устойчивые коллоидные растворы. Коллоидный раствор (раствор ВМС) - размеры частиц дисперсной среды и дисперсной фазы различаются в десятки и сотни раз. Коллоидный раствор состоит из жидкой фазы (золь) и

студенистой (гель).

Растворы белков способны к осаждению (коагуляции).

Различают 2 вида реакции осаждения:

1) обратимое осаждение. Белковая молекула в растворе удерживается

двумя факторами: зарядом и гидратной оболочкой. При высаливании нарушается гидратная, или водная оболочка, белка. Суммарный заряд

белковой молекулы, его структура и свойства при этом не изменяются.

Обратимое осаждение вызывается действием нейтральных солей аммония,

щелочных и щелочноземельных металлов (высаливание), спирта, ацетона,

эфира и некоторых других органических растворителей. Осажденные таким образом белки могут быть вновь растворены, например, если соли удалить методом диализа.

2) необратимое осаждение – денатурация. При этом нарушается гидратная оболочка белковой молекулы и изменяется ее суммарный заряд. Для большинства белков изоэлектрическая точка соответствует слабокислой среде

(рН около 5,0). Снятие заряда осуществляется путем подведения рН к

изоэлектрической точке. Удаление гидратной оболочки производится

водоотнимающими средствами (органические растворители, соли

13

щелочноземельных металлов в высокой концентрации), изменением температуры и др.

Лабораторная работа №2

ДИАЛИЗ РАСТВОРОВ БЕЛКОВ

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

С помощью диализа очищают высокомолекулярные растворы белковых веществ от примеси низкомолекулярных соединений (солей, сахаров и др.).

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) раствор яичного белка с хлористым натрием; 2) AgNO3, 0,5 % (в склянке из темного стекла); 3) HNO3, 10 %; 4) NaOH, 10 %; 5) CuSO4, 1 %; 6) кусочки целлофана размером 12,5х12,5 см; 7) дистиллированная вода; 8) стакан,

стеклянные палочки.

ХОД РАБОТЫ:

В мешочек из целлофана наливают до половины раствор яичного белка (с

хлористым натрием). Мешочек подвешивают на стеклянной палочке и погружают в стакан с дистиллированной водой. Диализ проводят при комнатной температуре. Через 40-60 минут из стакана берут в две пробирки по

2 мл воды. В одной пробирке проводят реакцию на ионы хлора, для чего воду подкисляют несколькими каплями 10 % раствора азотной кислоты и добавляют

2-3 капли раствора азотнокислого серебра, выпадает осадок хлористого серебра. С пробой во второй пробирке производят биуретовую реакцию. Если диализ проводится правильно, биуретовая реакция будет отрицательной.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОД:

14

Лабораторная работа №3

ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ ВЫСАЛИВАНИЕМ

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Высаливание – это обратимый процесс. Нейтральные соли аммония,

щелочных и щелочноземельных металлов – Na2SO4, (NH4)2SO4, NaCl, MgSO4 и

другие нейтрализуют заряд белковых частиц и вызывают их дегидратацию, что ведет к выпадению в осадок. Осадки можно снова растворить в воде, при этом наблюдается значительная степень восстановления свойств белков (например,

ферментативной активности, антигенных свойств и т.д.). Высаливанием пользуются для разделения белковых фракций, очистки белков, получения их в кристаллическом виде.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) раствор яичного белка с хлористым натрием; 2) NaCl, кристаллический,

тонко растертый порошок (в виде пудры); 3) (NH4)2SO4, кристаллический,

тонко растертый порошок; 4) (NH4)2SO4, насыщенный раствор; 5) MgSO4,

кристаллический, тонко растертый порошок; 6) СН3СООН, 1 %; 7) NaOH, 10 %; 8) CuSO4, 1 %; 9) пробирки, бумажные фильтры.

ХОД РАБОТЫ:

1. Осаждение сернокислым аммонием. В пробирку наливают 2-3 мл раствора белка, добавляют равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония и перемешивают. Выпадает осадок глобулинов, альбумины остаются в растворе. Осадок отфильтровывают через бумажный фильтр.

К фильтрату добавляют тонко растертый порошок сернокислого аммония до получения насыщенного раствора (последняя порция соли уже не растворяется). Выпадает осадок альбуминов, который также отфильтровывают.

С фильтратом проделывают биуретовую реакцию. При полном осаждении белков она должна быть отрицательной.

2. Осаждение сернокислым магнием или хлористым натрием. В 2

пробирки наливают по 2-3 мл раствора яичного белка и добавляют (до

15

получения насыщенного раствора) в одну пробирку порошок хлористого натрия, в другую – сернокислого магния. Через 5-6 мин. в пробирках замечается выпадение осадков (глобулины). Альбумины в нейтральных растворах солей щелочных и щелочноземельных металлов не осаждаются.

Содержимое пробирок отфильтровывают через бумажные фильтры. В

фильтратах – альбумины. Фильтраты подкисляют 1 % раствором уксусной кислоты – появляются осадки альбуминов. Их отфильтровывают, а в фильтратах с помощью биуретовой реакции доказывают отсутствие белка.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОД:

Лабораторная работа №4

ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ ПРИ КИПЯЧЕНИИ

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Воздействие высокой температуры ведет к тепловой денатурации белков, в

результате которой происходят необратимые изменения физико-химических и биологических свойств макромолекул.

На скорость и интенсивность процесса будут влиять рН и добавление электролитов. Быстро и наиболее полно белки денатурируют в изоэлектрической точке. Сдвиги рН в кислую и щелочную стороны затормаживают процесс осаждения белков. В сильно кислых и сильно щелочных растворах осаждения белков при кипячении практически не происходит. При добавлении кислот молекулы белка заряжаются положительно, в щелочных растворах они приобретают отрицательные заряды.

Прибавление электролитов (например, хлористого натрия) ускоряет процесс осаждения даже в кислой среде.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) раствор яичного белка (без добавления хлористого натрия); 2)

CH3COOH, 1 %; 10 %; 3) NaOH, 10 %; 4) NaCl, насыщенный раствор; 5)

пробирки; спиртовки; держатели.

16

ХОД РАБОТЫ:

В пять пробирок наливают по 5 капель раствора яичного белка.

1. В первой пробирке нейтральный раствор белка нагревают до кипения.

Жидкость мутнеет, поскольку разрушаются водные оболочки вокруг молекулы белка, и происходит укрупнение его частиц.

2.Во вторую пробирку добавляют 1 каплю 1 % раствора CH3COOH и

нагревают. Хлопьевидный осадок белка выпадает скорее и полнее, т.к. при подкислении рН раствора приблизится к изоэлектрической точке белка.

3.В третью пробирку добавляют 0,5 мл 10 % раствора CH3COOH и

нагревают. Даже при кипячении осадка не образуется, поскольку белковые мицеллы перезаряжаются и несут положительный заряд, что повышает их устойчивость.

4.В четвертую пробирку приливают 5 капель 10 % CH3COOH и 2 капли насыщенного раствора NaCl и нагревают. Выпадает белый хлопьевидный осадок, т.к. частицы белка теряют заряд вследствие взаимодействия белка с разноименно заряженными ионами хлористого натрия, а так же теряют гидратную оболочку.

5.В пятую пробирку добавляют 2 капли 10 % раствора NaOH, создавая щелочную среду. При кипячении жидкости осадка не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка увеличивается.

Результаты занести в таблицу 3. Отметить положительную реакцию осаждения плюсом, а отрицательную - минусом. Указать в каждом случае причины появления или отсутствия осадка белка.

ВЫВОД:

17

Лабораторная работа №5

ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ СОЛЯМИ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Осаждение белков солями тяжелых металлов (в отличие от высаливания)

происходит при небольших концентрациях солей. Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.) адсорбируют их,

образуя с ними солеобразные и комплексные соединения, растворимые в избытке этих солей (за исключением солей AgNO3, HgCl2), но нерастворимые в воде. Соли тяжелых металлов вызывают необратимое осаждение белков, т.е.

денатурацию. Растворение осадка в избытке солей называется адсорбционной пептизацией. Данное явление происходит вследствие возникновения одноименного положительного заряда на частицах белка.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) раствор яичного белка; 2) CuSO4, 5 %; 3) (CH3COO)2Pb, 5 %; 4) AgNO3, 3 %; 5) FeCl3, 5 %; 6) пробирки.

ХОД РАБОТЫ:

В 4 пробирки наливают по 1-2 мл раствора белка и по каплям добавляют растворы солей: в 1-ую – уксуснокислого свинца; во 2-ую - сернокислой меди;

в 3-ю – хлорного железа; в 4-ую – азотнокислого серебра (до выпадения осадков).

Затем прибавляют избыток указанных солей.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОД:

18

Лабораторная работа №6

ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ

КОНЦЕНТРИРОВАННЫМИ МИНЕРАЛЬНЫМИ КИСЛОТАМИ

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Концентрированные минеральные кислоты вызывают резкую дегидратацию белковых частиц и нейтрализацию их заряда, при этом происходит образование комплексных соединений. В результате происходит денатурация белка. Ортофосфорная кислота осадка не дает. В избытке всех минеральных кислот, за исключением азотной, выпавший в осадок белок растворяется.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) раствор яичного белка; 2) HNO3, конц.; 3) H2SO4, конц.; 4) HCl, конц.; 5)

пробирки.

ХОД РАБОТЫ:

В3 пробирки наливают по 1 мл кислот: в 1-ую – серной; во 2-ую – азотной;

в3-ю – соляной. Пробирки наклоняют под углом 45 º и осторожно (из пипетки)

наслаивают по стенке раствор белка (пробирку следует держать отверстием от себя!). На границе белка и кислоты появляется белое кольцо.

Пробирки осторожно встряхивают и добавляют в них избыток соответствующих кислот.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОД:

Лабораторная работа №7

ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ ОРГАНИЧЕСКИМИ ВЕЩЕСТВАМИ

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Органические кислоты вызывают необратимое осаждение белков, чаще используют растворы трихлоруксусной и сульфосалициловой кислот.

Сульфосалициловая кислота кроме белков осаждает также продукты их распада

19

- высокомолекулярные пептоны и полипептиды. Трихлоруксусная кислота

способна осаждать только белки и не осаждает продукты распада белков.

Ворганических растворителях (спирт, ацетон и др.) белки не растворяются

ивыпадают в осадок. В зависимости от природы белка для его осаждения требуются различные концентрации спирта. Спирт связывает воду, вызывая дегидратацию мицелл белка и неустойчивость их в растворе. При осаждении спиртом раствор белка должен быть нейтральным или слабокислым, но не щелочным. Реакция облегчается присутствием электролита хлористого натрия вследствие снятия заряда с частиц белка. Реакция осаждения белка спиртом или кратковременным действием спирта обратима при охлаждении. Если осадок быстро отделить от спирта, то белок может сохранить нативное состояние.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) сульфосалициловая кислота, 20 %; 2) трихлоруксусная кислота, 10 %; 3)

этиловый спирт; 4) раствор яичного белка; 5) пробирки.

ХОД РАБОТЫ:

В3 пробирки отбирают по 5 капель раствора яичного белка.

В1-ую пробирку добавляют 2 капли раствора сульфосалициловой кислоты. Во 2-ую – 2 капли трихлоруксусной кислоты. В 3-ю приливают 15-20

капель этилового спирта (раствор мутнеет), затем добавить 1 каплю насыщенного раствора хлористого натрия.

РЕЗУЛЬТАТ и ВЫВОД:

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:

Объясните факторы устойчивости коллоидного раствора белка.

От чего зависит заряд белка в водном растворе?

Что такое изоэлектрическая точка белка? Какой заряд будут иметь водные растворы белка с избыточным количеством свободных карбоксильных групп?

Какой заряд будут иметь водные растворы белка с избыточным количеством аминогрупп? В какой среде будет ИЭТ такого белка?

20