12. Микробиологическая диагностика.

Микробиологические тесты направлены на обнаружение маркёрных бактерий и определение их количества. Они показаны при агрессивном пародонтите, рецидивирующих формах, а также при тяжёлом пародонтите на фоне системных заболеваний (сахарный диабет и др.). Микробиологические методы исследования позволяют решить вопрос о назначении антимикробной терапии и показывают насколько успешно проводимое лечение.

Получение мазка. Для получения бактерий поддесневого налёта чаще всего используют бумажные штифты. Перед взятием мазка необходимо очистить участок от наддесневого налёта и тщательно высушить. Затем в карман на всю глубину вводят бумажный штифт и оставляют на 10с. В зависимости от используемого метода бумажный штифт помещают в транспортировочный контейнер с жидкой средой или без неё. Контейнер герметично закрывают и отправляют в лабораторию.

Микроскопия в тёмном поле. Эти методы позволяют провести ограниченную бактериальную диагностику в условиях стоматологического кабинета. Не требуется фиксация или окрашивание по Граму; методика быстрая и несложная. Однако определить можно только морфотип, т.е. форму бактерий и их подвижность. Если обнаруживаются в основном кокки и неподвижные палочки, это говорит о малом количестве патогенов. Обнаружение многочисленных подвижных бактерий (палочек, спирохет) свидетельствует об активной фазе воспаления в кармане и повышенном уровне потенциально патогенных представителей микрофлоры.

Выращивание культур бактерий. Это один из «классических» методов диагностики. Для культивирования бактерий они должны оставаться живыми. Пародонтопатогенные маркёрные бактерии в основном анаэробные, что создаёт проблему для забора образцов и их транспортировки. Помимо этого, метод занимает много времени, требует микробиологических знаний и специального лабораторного оборудования. Это обуславливает высокую стоимость анализа. Анаэробные бактерии полости рта растут медленно, поэтому окончательного результата зачастую приходится ждать до 3-х недель. Однако, одно из преимуществ метода – возможность построения антибиотикограммы, т.е. определения чувствительности и резистентности маркерных организмов к антибиотикам.

Гибридизация ДНК и генный анализ. Для этого используют видоспецифические тесты, которые представляют собой последовательности нуклеатидов (24-30 оснований) с радиоактивной маркировкой. Эти последовательности связываются с комплементарными ДНК или РНК бактерий (гибридизация). Жизнеспособные бактерии не требуются, поэтому транспортировка не представляет сложностей. Для проведения теста бактерии подвергают лизису, в процессе которого происходит разделение и фрагментация цепей ДНК и РНК и их прикрепление к мембране. Техника гибридизации: цепи ДНК отделяются друг от друга, фрагментируются и примыкают к мембране. Маркированные последовательности оснований находят комплементарные участки ДНК и связываются с ними. Идентификация проводится ауторентгенографическим или ферментным (цветная реакция) методом.

Полимеразная цепная реакция. Преимуществами этой методики явля-ются: высокая специфичность, быстрота (несколько часов), необязательное присутствие живых микроорганизмов. Для этого выявляются не сами живые бактерии, а их нуклеиновые кислоты. Метод ПЦР сочетает в себе высочайшую чувствительность всех микробиологических методов и направлен на выявление «маркерных» микроорганизмов. При этом данный метод исключает различные осложнения и потенциально ошибочные этапы. Установленный пороговый показатель теста обеспечивает то, что любой положительный результат имеет клиническое значение, а те концентрации бактерий, которые могут присутствовать в здоровой слизистой оболочке, дают отрицательный результат.

У каждой бактерии есть лишь одна молекула ДНК, зато рибосомальных РНК в тысячи раз больше. Для гибридизации ДНК/РНК не требуется копирование бактериальных рРНК. Для гибридизации ДНК/ДНК необходимо увеличить количество молекул ДНК. Для этого применяется полимеразная цепная реакция. Достаточно 20-30 циклов, чтобы увеличить количество ДНК в миллион раз.

Схема ПЦР: 1). Разделение ДНК на две одинаковые цепи. 2) Специфические последовательности праймеров А и В. 3) Восстановление структуру двойной спирали нуклеиновых кислот. 4) Полимераза удваивает последовательности.

Реакция антиген-антитело. Иммунологическое определение бактерий можно провести по их специфическим антигенам (Аг). Это поверхностные маркеры (структуры типа пилей и фимбрий, чаще углеводы или гликопротеины), к которым прикрепляются специфические моноклональные антитела (Ат). Чтобы сделать видимым связывание Аг и Ат, используются специально подготовленные антитела, маркированные так называемой молекулой-оповестителем (МО). Маркировки проводят с помощью ферментоподобных красителей или флуоресцентных веществ.

Прямая и непрямая иммунофлуоресценция. Этот метод позволяет увидеть реакцию связывания Аг и Ат/ используя флуоресцентный микроскоп. Бактерии связываются с антителами посредством специфических поверхностных антигенов; при этом антитела видны в ультрафиолетовых лучах, как светящиеся молекулы. При этом видны как живые, так и погибшие бактерии.

Ферментные бактериальные тесты. Некоторые пародонтопатогенные бактерии в ходе метаболизма вырабатывают трипсиноподобный фермент пептидазу, способный разрушать БАНА. БАНА – это бензоиларгинин-2-нафтиламид, синтетический субстрат, который гиролизуется бактериальной пептидазой. Один из продуктов гидролиза – это β-нафтиламид, видимый благодаря цветной реакции. Именно он подтверждает наличие патогенных бактерий. БАНА-тесты относительно недороги и могут выполняться средним медицинским персоналом. Строго положительная реакция говорит о том, что кюретаж пародонтальных карманов необходимо дополнить антибиотиками против облигатных анаэробов. Однако, другая, менее патогенная флора также может давать положительную реакцию, что говорит об ограничениях данного метода.

Домашнее задание: Составить план клинического обследования пациента с патологией пародонта.

Клинические демонстрации:

1) Осмотр и лечение курируемого больного с патологией пародонта или с заболеваниями зубов.

2) Демонстрация зондирования пародонтальных кармановс помощью пародонтального зонда; определения подвижности зубов; определения степени кровоточивости десны; определения степени вовлечения фуркаций в патологический процесс; определения уровня рецессии десны; определения степени гиперестезии зубов и патологической стираемости.

3) Демонстрация работы на диагностической системе Florida-probe.

УИРС: оформление пародонтальной карты, вкладыша - плана комплексного обследования и вкладыша – плана комплексного лечения больного с патологией пародонта курируемого больной.

Учебно-методический материал:

1. Методические указания по теме «Клинические и рентгенологические методы обследования больных с заболеваниями пародонта, пародонтологические индексы».

2. Электронные пародонтологические карты пациентов, полученные с помощью диагностической системы Florida-probe.

3. DVD-фильм о диагностической системе Florida-probe.

4. Наглядные пособия-инструкции о приборе «Периотест» и «БАНА-тест».

5. Компьютерная презентация по теме: «Классификация и диагностика заболеваний пародонта»

Самостоятельная работа студентов: прием пациентов; заполнение историй болезни и листов учета практических навыков.

Основная литература:

1. Лекции.

2. Боровский, Е.В. Терапевтическая стоматология [Текст]: учеб. пособие для вузов / Е.В. Боровский. - М.: [б. и.], 2009. - 798с.

3. Грудянов, А.И. Заболевания пародонта [Текст]: учеб. пособие для вузов /А.И. Грудянов.- М.: Мед. информ. агентство, 2009.- 331с.: рис. – Библиогр. в конце глав

4. Терапевтическая стоматология [Текст]: учеб. пособие для вузов: в 3 ч./ под ред. Г.М. Барера. – М. – ГЭОТАР – Медиа, 2008. – ч. 2. – Болезни пародонта. – 224 с.: 236 ил.

Дополнительная литература:

1. Вольф Герберт. Пародонтология [Текст]: рук-во – атлас /Герберт Вольф, Эдит М. Ратейцхак, Клаус Ратейцхаук/ редак. Г.М. Барер.- М.: МЕД пресс-информ, 2008.- 548 с.

2. Григорьян, А.С.Болезни пародонта. Патогенез, диагностика и лечение [Текст]: руководство для врачей/ А.С. Григорьян, А.И. Грудянов, Н.А, Рабухина. - М.: Мед. информ. агентство, 2004 – 287 с. – Библиограф. в конце глав.

3. Грудянов, А.И. Методы диагностики воспалительных заболеваний пародонта: рук –во для врачей [Текст] /А.И. Грудянов, О.А.Зорина. – М.: Мед. информ. агентство, 2009. – 110 с.: рис, Библиогр.: с.101 – 110.

4. Цепов, Л.М. Диагностика и лечение заболеваний пародонта [Текст]/ Л.М. Цепов, Николаев А.И.: изд. 2-ое исп. и доп. – М.: МЕДпресс - информ, 2008. - 195с. – Библиограф. с. 193-195.

20