Методические указания к практической работе

Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)

Место проведения занятия: учебная аудитория

Материально-техническое оснащение – таблицы, стенды, микроскопы, микропрепараты

Хронометраж практического занятия:

1. Вводное слово преподавателя – 5 мин

2. Проверка исходного уровня знаний (тест-контроль) – 15 мин

3. Разбор теоретических вопросов по теме – 80 мин

1. Принципы классификации микроорганизмов («Определитель бактерий» Берджи, 1994-1996 гг.)

2. Геносистематика микроорганизмов

3. Понятие о виде у бактерий

4. Бинарная номенклатура микроорганизмов

5. Основное отличие прокариотов от эукариотов

6. Типы современных микроскопов

7. Иммерсионный микроскоп. Разрешающая способность и общее увеличение

8. Правила работы с иммерсионным микроскопом

9. Принцип микроскопии в темном поле

10. Фазово-контрастный микроскоп

11. Люминесцентный микроскоп

12. Электронный микроскоп

13. Основные формы бактерий

4. Выполнение практической работы – 35 мин

Практическая работа

1. Ознакомиться с иммерсионной системой микроскопа

2. Ознакомится с принципом преломления света в различных средах (воздух, масло, вода) (зарисовать)

3. Изучить методику приготовления мазка (записать в тетрадь)

3.1. Приготовление мазка из чистой культуры состоит из нескольких последовательных операций: подготовка мазка, высушивание, фиксация и окраска. Исследуемый материал наносят на чистое обезжиренное предметное стекло. Для взятия бактериальной культуры:

- нагревают до покраснения бактериальную петлю в пламени горелки;

- берут пробирку с исследуемой культурой в левую руку так, чтобы видеть поверхность среды; вращательным движением вынимают пробку из пробирки, прижимая ее мизинцем и безымянным пальцами правой руки к ладони;

- обжигают край пробирки, осторожно вводят петлю и берут исследуемый материал;

- вынимают петлю, обжигают край пробирки и закрывают пробкой;

- взятый материал осторожно распределяют по предметному стеклу тонким слоем, после чего бактериальную петлю стерилизуют в пламени горелки;

- если препарат готовят из бактериальной культуры, выращенной на плотной среде, то на предметное стекло предварительно наносят каплю стерильного физиологического раствора;

- мазки высушивают на воздухе при комнатной температуре или в токе теплого воздуха, держа предметное стекло высоко над пламенем горелки. Нельзя допускать закипания материала, т.к. при этом может нарушиться структура микроорганизмов;

- фиксация препарата: высушенные мазки подвергают термической (предметное стекло мазком вверх проводят несколько раз через пламя горелки) или химической (фиксирующие растворы: формалин, спирты, глутаральдегид, жидкость Карнуа, ацетон, пары осмиевой кислоты) обработке, в результате которой бактерии погибают и плотно прикрепляются к поверхности стекла.

Окраска мазка по методу Грама. 1) окрасить фиксированный мазок генциан-виолетом (2 мин, через фильтровальную бумагу); 2) бумагу удалить, оставшуюся краску слить; 3) окрасить мазок раствором Люголя (1 мин); 4) раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% спирта (на 30–40 секунд осторожно покачивая стеклом); 5) тщательно смыть спирт водой; 6) окрасить водным фуксином (2 мин); 7) промыть водой и высушить при помощи фильтровальной бумаги; 8) микроскопируют с иммерсией.

Все бактерии по отношению к окраске по Граму делят на грамположительные – темно-фиолетовые цвета и грамотрицательные – красные. Способность микроорганизмов окрашиваться в тот или иной цвет зависит от химического состава клеточной стенки. Грамположительные бактерии в клеточной стенке содержат многослойный пептидогликан, связанный с тейхоевыми кислотами, которые обусловливают прочную связь комплекса генциан-виолетового с йодом и резистентность к обесцвечиванию спиртом. У грамотрицательных бактерий такой комплекс не образуется и они чувствительны к обесцвечиванию спиртом.

4. Изучение мазков из культур Streptococcus, Vibrio, Sarcina (зарисовать)

5. Изучение мазка агаровой культуры Staphylococcus, окраска метиленовой синькой, микроскопия (зарисовать)

6. Изучение мазка агаровой культуры Escherichia coli, окраска фуксином, микроскопия (зарисовать)

7. Изучение мазка агаровых культур E.coli и Bacillus cereus (смесь из них), окраска по Граму, микроскопия (зарисовать)