Определение чувствительности бактерий к антибиотикам

 

Оценка чувствительности микробов к антибиотикам и изучению их фармакокинетики в организме больного является основными лабораторными показателями, которые при их сопоставлении позволяют прогнозировать эффективность антибактериальной терапии. Кроме того, результаты определения антибиотикочутливостииспользуют в качестве маркера, что позволяет обнаруживать и контролировать изменения антибиотикограммы возбудителей в динамике, использовать детерминанты резистентности, которые чаще всего встречаются, или их комбинации как дополнительные маркеры при диагностике внутрибольничных инфекций, для выявления источников инфицирования и путей распространения полирезистентних штаммов. Такие данные, полученные и обобщенные в разных регионах страны в течение фиксированных промежутков времени, используются при формировании политики антибактериальной терапии и определении номенклатуры антибиотиков, которые выпускаются в  стране.

 

Наиболее распространенными методами определения антибиотикочутливости возбудителей инфекций является диско-дифузионный (метод дисков) и серийных разведений.

 

Питательные среды для определения чувствительности бактерий к антибиотикам должны отвечать таким требованиям:

• быть стандартными и обеспечивать оптимальные условия роста микроорганизмов;

• не содержать ингибиторов бактериального роста и большого количества стимуляторов;

• не иметь веществ, которые подавляют активность препаратов.

 

На результаты исследование может существенно влиять значение рН среды. Целесообразнее всего выбирать нейтральное или слабо щелочную среду (рН 7,0-7,4), поскольку эти значения пригодны для большинства антибиотиков. При определении чувствительности бактерий используют бульйон и 1,5-2 % агар на перевареХоттингера, обычный мясо-пептонний бульйон и 1,5-2 % агар на нем, среда АГВ (агар Гивенталя-Ведьминой), агар Mueller-Hinton 2. Они пригодны при определенииантибиотикочутливости стафилококков, энтеробактерий, псевдомонад. Однако стрептококки и гемофильные бактерии требуют добавки ростовых факторов; дрожжи и анаэробные бактерии – специальных сред и определенных условий культивирования. На результаты определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам-аминогликозидам, полимиксинам, тетрациклинам влияет содержание в питательных средах катионов кальция, магния, что особенно важно при исследовании P. aeruginosa. Оптимальное содержание – 50 мг/л Са2+ и 25 мг/л Mg2+. Большинство сред, которые выпускаются странами СНГ, за этим показателем, как правило, не стандартизируются. Это приводит к существенным колебаниям содержания двувалентных катионов в разных сериях сред, даже если они выпускаются одним предприятием, и искажает результаты.

 

Диско-диффузионный метод определения антибиотикочутливости является самым простым качественным методом и широко используется для эпидемиологического контроля резистентности. Достоверность результатов обеспечивается путем стандартизации проведения теста на всех этапах исследования: выбор и изготовление питательных сред с учетом всех свойств возможных возбудителей, взятия проб и условия их доставки, изготовления и разливания посевного материала на поверхность агара, выбор дисков (использование набора дисков в соответствии с видом выделенного возбудителя и локализацией инфекции).

Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам следует определять только в чистой культуре. Однако в ряде случаев для быстрого получения ориентировочных данных об антибиотикограмме бактерий используют непосредственно патологический материал. Плотные субстраты (мокрота, гной, кал и др.) растирают, жидкости (моча, экссудаты и др.) центрифугируют, а для посева используют осадок. Исследуемый материал наносят на поверхность питательной среды петлей или ватным тампоном. После получения чистой культуры исследования повторяют.

Для изготовления инокулюма 5-10 однородных колоний суспендируют в 2 мл жидкой среды или физраствора. Бактериальную суспензию (10³-10⁵колониеобразующих единиц в 1 мл в зависимости от вида микробов) в объеме 1 мл равномерно распределяют по поверхности среды при покачивании чашки, избыток жидкости удаляют пипеткой. Чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 20-30 мин, а затем на них на одинаковом расстоянии кладут диски с антибиотиками.

Равномерность газона, которая определяется величиной посевной дозы, – самый главный фактор получения достоверных результатов и подлежит количественной оценке и качественной стандартизации. Степень нестандартности результатов исследования, который связан с изменением величины дозы инокулюма, варьирует в зависимости от вида возбудителей, свойств антибиотика и других факторов. При небольшой дозе инокулюма при определении чувствительности к бета-лактамнихпрепаратам пеницилиназо-образующих бактерий можно получить большие размеры зон задержки роста, которые создают представление о высокой чувствительности штаммов. И, напротив, размер зон резко снижается при увеличении плотности инокулюма. Решающее значение имеет его величина при определении чувствительности к бета-лактамным антибиотикам метицилинорезистентних вариантов стафилококков в результате гетерогенности их именно за показателем чувствительности. Для выявления стойкости к метицилину необходимо придерживаться определенных температурных режимов (30-35 °С). Поскольку эти стафилококки медленнее растут при 37 °С, следует их культивировать на средах с добавлением 5 % хлорида натрия. Результаты учитывают через 24 и 48 год. Для контроля стандартности проведения исследований в каждом опыте используют тестовые культуры с известной чувствительностью к антибиотикам. ВООЗрекомендует три штамма типичных культур: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. При определении антибиотикочутливости выделенных штаммов следует сопоставлять полученные данные с размерами зон угнетения роста вокруг дисков с антибиотиками для контрольных культур. Их сравнивают с допустимыми контрольными значениями.

Если диаметры зон угнетения роста контрольных штаммов находятся в определенных границах, это свидетельствует о достаточной стандартизации и точности проведенных экспериментов. Не следует размещать на чашке Петри свыше 6 дисков, так как при больших диаметрах зон задержки роста это может быть источником ошибок и влиять на количественную интерпретацию результатов. Правильный подбор набора дисков является фактором, который определяет корректность исследований и, без сомнения, интерпретацию результатов. Ориентировочные данные относительно выбора наборов дисков с учетом вида выделенного возбудителя и локализации инфекции приведены в таблице.

Оценку результатов проводят за таблицей, которая содержит предельные значения диаметров зон задержки роста для резистентных, умеренно резистентных и чувствительных штаммов, а также значения минимальной подавляющей (ингибирующей) концентрации (МПК, МИК) антибиотиков для стойких и чувствительных штаммов.

Полученные значения диаметров зон задержки роста сравнивают с контрольными значениями таблицы и относят исследуемые штаммы к одной из трех категорий чувствительности.

 

 

Метод диффузии с помощью дисков является качественным методом. Он позволяет установить лишь факт чувствительности или резистентности возбудителей инфекции. Однако установлена коррелятивная связь размеров зон угнетения роста исследуемых штаммов и значений МИК (минимальная концентрация препарата, которая ингибирует рост исследуемого штамма) антибиотиков позволяет оценить степень чувствительности и количественно, используя данные, приведенные в специальных таблицах. За своей степенью чувствительности к антибиотикам микроорганизмы разделяются на три группы:

1 группа – чувствительные к антибиотикам (возбудители уничтожаются в организме при использовании обычных терапевтических доз препаратов);

2 группа – умеренно резистентные (для них лечебный эффект может быть достигнут при использовании максимальных терапевтических доз препаратов);

3 группа – резистентные (бактерицидных концентраций препаратов в организме создать невозможно, потому что они будут токсичными).

 

                                                        Предельные границы диаметров зон задержки роста эталонных штаммов

Антибиотики	Диаметр зоны замедления роста, мм
	на средах №1, №2			на среде АГВ
	S. aureus АТСС 25923	E. coli АТСС 25922	P. aeruginosa АТСС 27853	S. aureus АТСС 25923	E. coli АТСС 25922	P. aeruginosa АТСС 27853
Бензинпеницылин	-	-	-	29-38	-	-
Ампицилин	24-35	13-20	-	30-36	14-20	-
Карбеницилин(25мкг)	-	-	-	32-38	14-20	-
Карбаныцилин (100мкг)	-	21-26	20-24	35-42	23-29	18-24
Метицилин	-	-	-	22-30	-	-
Оксацилин	27-32	-	-	24-30	-	-
Цефалотин	24-37	15-22	-	30-40	15-20	-
Стрептомицин	17-25	14-22	-	20-25	14-19	-
Неомицин	19-27	18-24	-	20-27	13-17	-
Канамицин	20-27	18-26	-	20-27	15-19	-
Гентамицин	20-28	20-27	16-24	22-32	21-30	16-26
Тетрациклин	20-29	19-26	-	22-31	17-26	-
Эритромицин	23-31	-	-	22-31	8-15	-
Олеандромицин	20-29	-	-	22-29	-	-
Линкомицин	24-32	-	-	24-32	-	-
Левомицетин	21-27	26-28	-	19-25	19-27	-
Рифампицин	-	-	-	26-34	7-11	-
Полимиксин	-	12-17	-	-	16-20	15-20
Ристомыцин	14-18	-	-	12-16	-	-