2 Вопрос

Методы изучения строения белков

Полный гидролиз либо в щелочной, либо в кислой среде.

Кислотный гидролиз проводят в течение 24 часов при t= 110 6-NHCl. Продукты гидролиза разделяются методом ионообменной хроматографии (на колонке) с сульфолированным полистиролом. Фракцинирование аминокислоты: с помощью нингидрона по окраске определяют количество аминокислоты. Затем вымывают и фотометрически определяют каждую аминокислоту. Таким образом можно определить легкие аминокислоты (отпечатки пальцев). Если белков малое количество 10^-9, то используют реактив- флуорескамин.

Задание: определить аминокислотную последовательность.

Надо убедиться, что цепь одна.

Способ Афинина для расщепления сульфидных мостиков.

1. Метод Сенгера

Метод позволяет определить N – концы 1 аминокислоту.

Другой реагент, который используется – дансилхлорид

2. Метод Эдмана – позволяет определить с N-конца десятки аминокислот

Эдман сконструировал прибор для последовательного определения аминокислот в длинных полипептидах. Прибор – секвенатор. белок помещен в виде тонкой пленки во вращающейся цилиндр. сосуд, где он подвергается расщеплению.1 цикл – не менее 2-х часов. С помощью него были расшифрованы 1 –не 60 аминокислот с N-конца миноглобинамета.

3. Определение 1-ой аминокислоты с С-конца гидразином.

4. Фермент карбоксипептидазы может последовательно отщеплять по 1-ой аминокислоте с С-конца.Используют для определения небольших полипептидов (до 100)

Если больше 100.

Трепсин – расщепляет пептидные связи, образованные с С-концом основных аминокислот – лизина и аргенина.

Хемотрепсин – расщепляет пептидную связь с с-конца ароматических и дикарбоновых кислот.

Разделяют хроматоргафически, начинают определять. Берут снова порцию полипептида. Расщепляют другим способом, с помощью химического реагента, используют бромциан – расщепление с С-конца метиламина. Смотрят, перекрывающиеся участки сопоставляют.

Гидроксиламин–NH₂OH- расщепляет связь аспарагин-глицин.

2-нитро-5тиоцианобензоат – расщепляет там где аминогруппа цистоина.

1953 г. – инсулин – самая 1-ая последовательность. Иммуноглобулин (4 полипептидные цепи) – самый крупный 1300 аминокислотных остатков.

В белках могут быть определены все аминокислоты.

Цветные реакции на белки.

Качественные реакции:

1. Общие

• Биуретовая

• Нингидриновая

2. Частные

А) биуретовая реакция – на пептидную связь – дают вещества, которые содержат не менее 2-ух пептидных связей –CO-NH-

Б) нингидриновая реакция – α – аминокислоты при высокой t-ре дают розово-фиолетовое окрашивание, за исключением: пролин – желтое.

Нингидрин используется в хроматографии для полного определения аминокислоты.

Частные реакции

А) Ксантопротеиновая на ароматические аминокислоты: триптофан, фенилаланин, тирозин и другие.

Б) реакция Милона на тирозин

В) реакция Фоля на цистин и цистеин.

Г) реакция Адамкевича на триптофан

Д) Сакагучи на аргенин

Е) Паули на гистидин и пирозин.

Ж) Нитропруссидная реакция – обусловлена присутствием в белке серусодержащих аминокислот, при кипячении с NaOH образуется [ NaFe³⁺(CN)₅NO] нитропруссид натрия, с Na₂S образует соединение красного цвета.