Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Применение бактериальных заквасок, стартовых культур и биопрепаратов. Учебно-методическое пособие
.pdf
2. Штаммы, полученные в результате индуцированного мута-
генеза.
3. Генетически модифицированные (рекомбинантные) микроорганизмы. Эти штаммы обладают самой высокой генетической
нестабильностью.
Промышленные штаммы должны соответствовать ряду требо-
ваний:
1. Безвредность для потребителя и работников предприятия.
2. Высокая скорость роста и синтеза целевого продукта.
3. Экономичность потребления питательной среды.
4. Направленность биосинтетической активности при минимальном количестве побочных продуктов.
5. Генетическая однородность и стабильность в отношении
к субстратам и условиям культивирования.
6. Отсутствие токсических веществ в целевом продукте и промышленных стоках.
7. Устойчивость к фагам и контаминирующей микрофлоре.
8. Способность к росту на дешевых и доступных субстратах,
когда можно использовать в качестве среды отходы пищевой
и химической промышленности.
Только в совокупности этих и других свойств можно оценить
полезность и рентабельность продуцента. Наиболее изучены и
чаще применяются в биотехнологии бактерии рода Clostridium,
Thermoanaerobacter, Bacillus, Acetobacter, Pseudomonas, Brev bacterium.
Основные виды микроорганизмов, используемых в промышленности для получения целевых продуктов, представлены в табл. 1.
Одноклеточные организмы характеризуются более высокими
скоростями процессов синтеза, чем высшие растения и животные.
Они могут перерабатывать в сутки объем биомассы, превышающий
массу клетки в 30–40 раз. В действительности есть разнообраз-
ные ограничивающие факторы. Однако возможности бактерий к
быстрому размножению намного превосходят возможности других видов организмов, и это свойство микроорганизмов является
важнейшим при производстве микробного белка и биологически
активных веществ (БАВ).
11
Бактерии биохимически универсальны, могут усваивать разнообразные питательные вещества и даже способны выбирать
наилучшие органические соединения из смеси, поэтому могут
приспосабливаться к разным условиям существования.
В последние годы расширяется применение смешанных микробных культур и их природных ассоциаций. По сравнению с монокультурами микробные ассоциации способны ассимилировать
сложные, неоднородные по составу субстраты, минерализовать сложные органические соединения, имея повышенную способность к
биотрансформации, устойчивость к воздействию неблагоприятных
Таблица 1
№ п/п Организм Продукт
1 Saccharomyces cerevisiae Пекарские дрожжи, вино, эль, саке
2 Streptococcus thermophilus Йогурт, ряженка
3 Propionibacterium shermanii Швейцарский сыр
4 Gluconobacterium suboxidans Уксус
5 Penicillium roquefortii Сыры типа рокфора
6 Aspergillus oryzae Саке
7 Saccharomyces cerevisiae Этанол
8 Clostridium acetobutylicum Ацетон
9 Xanthomonas campestris Полисахариды
10 Corynebacterium glutamicum L-лизин
11 Candida utilis Микробный белок
12 Propionibacterium shermanii Витамин В
13 Aspergilus oryzae Амилаза
14 Kluyveromyces fragilis Лактаза
15 Saccharomycopsis lipolytica Липаза
16 Bacillus Протеазы
17 Endothia parasitica Сычужный фермент
18 Leocanostoc mesenteroides Декстран
19 Xanthomonas campestris Ксантан
20 Penicillium chrysogenum Пенициллины
12
12
факторов среды и токсических веществ, а также повышенную про-
dx
dt
дуктивность и возможность обмена генетической информацией
между отдельными видами сообщества. Основные области применения смешанных культур: охрана окружающей среды, биодеградация и усвоение сложных субстратов, пищевая промышленность.
В любом биотехнологическом процессе ключевую роль играют
природа и физиолого-технологические свойства используемого
биологического объекта. Для роста микроорганизмов нужны исходный жизнеспособный посевной материал, источники энергии и
углерода, питательные вещества для синтеза биомассы, отсутствие
действия ингибиторов роста и оптимальные физико-химические
условия ферментации (рН, температура, аэрация и др.).
Процессы культивирования микроорганизмов в биотехнологических производствах направлены на получение целевых продуктов, в качестве которых могут выступать как сами клетки микроорганизмов, так и продукты их жизнедеятельности. В то же
время термин «культивирование» неразрывно связан с ростом
и размножением клеток микроорганизмов.
Критериями оценки эффективности биотехнологических процессов являются скорость роста продуцента, выход продукта, экономический коэффициент, энергозатраты и затраты на обезвреживание отходов.
Рост продуцента – это необратимое увеличение живой клеточ-
ной массы в результате размножения. Важнейшей количественной
характеристикой этого процесса является удельная скорость роста
µ, выражающая увеличение биомассы клеток в единицу времени.
Скорость роста продуцента служит одним из основных показателей, характеризующих адекватность условий ферментации.
Скорость роста (увеличение биомассы) организмов с бинарным
делением в хорошо перемешиваемой среде в периодической куль-
туре будет пропорциональна концентрации микробной биомассы:
где
– скорость роста; µ – коэффициент пропорциональности
,dxxdt= µ
(удельная скорость роста); х – биомасса.
13
Удельная скорость роста µ является одним из основных пара-
0
x
SS
метров, определяющих физиологическое состояние продуцента.
Ряд других параметров может быть выражен через этот показатель,
например, если удельная скорость роста равна 0,1 ч
–1
, то увеличение
биомассы составляет 10 % в ч. Таким образом, ростовые процессы
приводят к накоплению биомассы.
Эффективность биотехнологического процесса оценивается выходом продукта Y по субстрату («экономический коэффициент»)
и определяется как количество продукта, получаемого из данного
количества субстрата:
Y
=
,
−
где S и S
– конечная и исходная концентрации субстрата.
0
Данный коэффициент характеризует эффективность использования субстрата при получении целевого продукта и является очень
важной характеристикой, так как непосредственно связан с продуктивностью и позволяет влиять на себестоимость конечного продукта.
В биотехнологии большое значение имеет анализ основных закономерностей роста и развития культивируемых микроорганизмов.
В его основу положена кривая роста микроорганизмов в простых
периодических условиях (рис. 1).
Подбор необходимых для культивирования форм микроорганизмов с заданными свойствами включает несколько этапов: 1 – выделение микроорганизмов; 2 – получение накопительных культур;
3 – выделение чистых культур. Описание этапов культивирования
микроорганизмов приведено ниже.
1. Выделение микроорганизмов. Отбирают пробы из мест обитания
микроорганизмов – это почва, вода, растительные остатки и т. д.
Для углеводородокисляющих микроорганизмав таким местом может быть почва возле бензоколонок. Винные дрожжи встречаются
на винограде. Анаэробные целлюлозоразлагающие и метанобра-
зующие микроорганизмы в большом количестве обитают в рубце
жвачных животных.
2. Получение накопительных культур. Образцы вносят в жидкие
питательные среды определенного состава, создают благоприятные
14
4
5
3
1 и 2 (лаг-фаза и фаза ускорения роста) – адаптация клеток
к условиям культивирования и составу питательной среды;
3 (лог-фаза) – синтез первичных метаболитов, образование
биомассы; 4 и 5 (фаза торможения и стационарная) – синтез
2
1
Рис. 1. Кривая роста микроорганизмов:
вторичных метаболитов, «урожай биомассы»;
6 (фаза отмирания) − гибель клеток
6
условия для развития продуцента (температура, рН, источники
энергии, углерода, азота и т. д.). Для накопления продуцента холестериноксидазы используют среды с холестерином в качестве
единственного источника углерода; углеводородокисляющих микроорганизмов – среды с парафинами; продуцентов протеолитических или липолитических ферментов – среды, содержащие
белки или липиды.
3. Выделение чистых культур. Плотные питательные среды засе-
вают образцами проб из накопительных культур. Отдельные клетки
микроорганизмов на плотных питательных средах образуют изолированные колонии. При их пересеве получаются чистые культуры,
состоящие из клеток одного вида микроорганизма.
Другой путь подбора мироорганизма-продуцента – из коллекций.
Например, продуцентами антибиотиков чаще являются актиномицеты, мицелиальные грибы, этанола – дрожжи. Клон – культура,
15
полученная из одной клетки, чистая культура – совокупность особей
одного вида микроорганизмов, штамм – чистая культура микроор-
ганизмов одного вида, выделенная из какого-либо источника или
полученного в результате мутаций, обладающая особыми физиолого-биохимическими свойствами. Разные штаммы одного и того же
вида микроорганизма могут различаться по ряду технологических
свойств.
Контрольные вопросы
1. Перечислите требования, предъявляемые к микроорганизмам-про-
дуцентам метаболитов в биотехнологическом производстве.
2. Какие методы используют при получении новых высокопродуктив-
ных штаммов микроорганизмов?
3. Назовите несколько видов микроорганизмов, используемых в про-
мышленности для получения целевых продуктов.
4. Назовите критерии оценки эффективности биотехнологических
процессов и охарактеризуйте их.
5. Назовите основные фазы роста культуры в периодической культуре.
6. Какие группы целевых продуктов можно получить при биотехноло-
гическом культивировании микроорганизмов?
Г л а в а 2
Пропионовокислые бактерии (Propionibacterium) – род грамположительных факультативных анаэробных неподвижных бактерий. Они
синтезируют в процессе метаболизма пропионовую кислоту. Клетки
Propionibacterium обычно имеют вид палочек размером 0,5–0,8 ×
× 1,0–1,5 мкм; реже, в зависимости от условий и цикла развития, –
кокковидной, изогнутой или булавовидной формы. Propionibacterium
не образуют спор и размножаются бинарным делением. Пропионовокислые бактерии являются возбудителями пропионовокислого
брожения, при котором углеводы ферментируются с образованием
16
главных продуктов брожения – пропионовой кислоты и ее солей –
пропионатов. Кроме пропионовой кислоты, пропионовокислые
бактерии продуцируют уксусную кислоту, углекислый газ и др.
Propionibacterium обитают в желудочно-кишечном тракте жвачных
животных, часто обнаруживаются в сыром молоке. Микроскопи-
ческий препарат клеток микроорганизмов этого рода представлен
на рис. 2. Типовой вид этого рода – Propionibacterium freudenreichii.
Propionibacterium freudenreichii – мелкие, неподвижные, неспорообразующие, грамположительные полиморфные палочки размером
0,5–0,8 × 1–5 мкм. Их клетки бывают кокковидными, удлиненны-
ми, раздвоенными или разветвленными (встречаются булавовидные формы). Клетки одиночные, но могут быть в виде букв V или
Y. Факультативные анаэробы. Максимальный рост наблюдается
при температуре 30–37
°С и значении рН около 7. В молоке про-
пионовокислые бактерии развиваются медленно и свертывают
его через пять-семь дней. Предельная кислотность молока может
достигать 160–170
°Т.
Большинство пропионовокислых бактерий не может развиваться при значениях рН менее 4,5–5. Propionibacterium способны
переносить лишь низкое парциональное давление кислорода. Оптимальная температура их развития 30–35
°С. Propionibacterium,
Рис. 2. Морфология пропионовокислых
бактерий (Propionibacterium freudenreichii)
17
кроме сахаров и молочной кислоты, способны сбраживать пировиноградную кислоту, глицерин и другие вещества. Некото-
рые виды Propionibacterium способны продуцировать витамин B
12
В микробиологической промышленности в качестве продуцентов
витамина В
используют штамм Propionibaderium shermanii.
12
Пропионовокислые бактерии используют в сыроделии при
производстве полутвердых сыров с высокой температурой второго нагревания. После окончания молочнокислого брожения в
сырах начинается стадия развития пропионовокислых бактерий,
сбраживающих молочную кислоту с образованием уксусной и пропионовой кислот и диоксида углерода. Летучие кислоты придают
сырам специфические вкус и запах, а диоксид углерода участвует
в формировании рисунка сыра.
В производстве сыра эмменталь используются три вида бактерий −
стрептококки Streptococcus salivarius subspecies thermophilus, лактобакте-
рии Lactobacillus helveticus или Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus
и пропионовокислые бактерии Propionibacterium freudenreichii (подвид
shermanii). Молочнокислые бактерии (лактобактерии и стрептококки)
сбраживают лактозу и другие углеводы молока в молочную кислоту.
Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii потребляет выделяемую
другими бактериями молочную кислоту и продуцирует уксусную,
пропионовую кислоты и углекислый газ. Последний формируется в
пузырьки, в результате чего и получаются характерные в швейцарских
сортах дырки. Уксусная и пропионовая кислоты придают швейцарскому сыру его ореховый, сладкий вкус.
Propionibacterium freudenreichii в процессе метаболизма белков
продуцируют изовалериановую кислоту.
Всемирная гастроэнтерологическая организация (WGO) отмечает, что имеются доказательства, что пробиотик, включающий
штаммы Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii, Lactobacillus
rhamnosus GG, Lactobacillus rhamnosus LC705 и Bidobacterium breve
Bb99, уменьшает некоторые симптомы при синдроме раздраженного кишечника.
Штамм КМ-186 Propionibacterium freudenreichii ssp. sher-
manii входит в состав отечественных БАД «Йодпропионикс»
и «Селенпропионикс».
.
18
Уксуснокислые бактерии (ацетобактерии) относятся к роду Acetobacter, который включает семь видов. Наиболее распространен-
ный вид – Acetobacter aceti.
Acetobacter aceti – мелкие грамотрицательные подвижные па-
лочки размером 0,6–0,8 × 1–3 мкм. Встречаются нитевидные, эллипсовидные или имеющие вздутие формы. Клетки располагаются
одиночно или цепочками. Спор и капсул не образуют. Строгие
аэробы. Окисляют спирты в кислоты. К числу окисляемых соединений относятся одноатомные спирты, содержащие от двух до пяти
углеродных атомов, а также многоатомные спирты – производные
сахаров. Окисление первичных спиртов приводит к образованию
кислот. Бактерии способны окислять этиловый спирт в уксусную
кислоту, пропиловый спирт – в пропионовую кислоту, бутиловый
спирт – в масляную кислоту. Некоторые виды бактерий могут
окислять также глюкозу в глюконовую кислоту, ксилозу – в ксилоновую кислоту. Уксуснокислые бактерии довольно требовательны
к субстратам для роста. Почти все виды нуждаются в отдельных
витаминах, в первую очередь в пантотеновой кислоте, но есть формы, способные к синтезу всех факторов роста. Микроскопический
препарат микроорганизмов представлен на рис. 3.
Оптимальная температура для роста Acetobacter aceti − 20–35
оптимум рН составляет 5,4–6,3. Acetobacter aceti выдерживает кон-
центрацию спирта до 10–11 %. Уксуснокислые бактерии часто
развиваются вслед за дрожжами, используя продукт спиртового
брожения – спирт как субстрат для роста.
При накоплении в сбраживаемом сусле 0,01 % уксусной кислоты
задерживается жизнедеятельность дрожжей, а при 0,2 % она полностью подавляется. Эти бактерии применяются в промышленной
биотехнологии для получения столового уксуса и в производстве
аскорбиновой кислоты (на этапе окисления сорбита в сорбозу).
Характерные колонии бактерии образуют только на поверхности
твердой питательной среды, на жидких средах они образуют пленку.
В молоке развиваются плохо и кислоты не синтезируют. Уксуснокислые бактерии входят в состав кефирных грибков. В производстве
°С,
19
а) б)
Рис. 3. Уксуснокислые бактерии (Acetobacter aceti):
а – увеличение в 2000 раз; б – увеличение в 4000 раз
кефира они играют положительную роль при умеренном развитии.
Их развитие в сметане, твороге, простокваше может вызвать
появление нежелательного запаха и привкуса уксусной кислоты,
а также ослизнение продукта.
Бифидобактерии включены в семейство Actinomycetaceae, род
Bidobacterium. Они являются представителями нормальной ми-
крофлоры кишечника человека и животных и обладают высокой
антагонистической активностью по отношению к патогенным
и условно-патогенным микроорганизмам.
Клетки Bidobacterium представляют собой мелкие, иногда ветвящиеся палочки Y- или V-формы, прямые или изогнутые, булавовидные или лопатовидные (рис. 4).
Клетки располагаются одиночно, парами, палисадом (розетками),
редко – цепочками. Размер клеток составляет 0,5–1,3 × 1,5–8 мкм.
Бифидобактерии по Граму окрашиваются положительно, не образуют
эндоспор, неподвижны. Некоторые штаммы способны образовывать
микрокапсулу.
Бифидобактерии являются строгими анаэробами. Оптимальная температура их роста 36–40
20–50
°С. Оптимальное значение рН среды 6–7. При рН ниже 4,5 и
°С, температурные пределы роста
выше 8,5 рост микроорганизмов прекращается. Для размножения
20
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]