Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Применение бактериальных заквасок, стартовых культур и биопрепаратов. Учебно-методическое пособие
.pdf
Вопросы для самоконтроля
1. Какое лабораторное оборудование используется для изучения мор-
фологических свойств микроорганизмов?
2. Каково назначение конденсора?
3. Что относится к оптической части микроскопа?
4. Какое будет увеличение рассматриваемого объекта при использовании объектива, имеющего увеличение в 10 раз, и окуляра, имеющего
увеличение в 40 раз?
5. Для чего используют простые методы окрашивания?
6. Какова цель приготовления окрашенных препаратов?
7. Какие краски применяют для окраски бактерий?
8. Каков порядок приготовления препарата (мазка) для окрашивания?
9. Каковы сущность и техника окраски препаратов по методу Грама?
10. На какие группы при окраске по Граму делятся бактерии?
Цель работы – ознакомиться с методами выделения чистых
культур микроорганизмов и освоить метод истощающего посева
и предварительного разведения.
В естественных условиях исследуемые объекты содержат смешанную микрофлору. Идентификация вида возможна только при
работе с чистыми культурами, поэтому качественный анализ смешанной микрофлоры объекта начинается с выделения микроорганизмов в виде чистой культуры. Чистая культура – культура одного
вида, выращенная как потомство одной клетки.
Методы выделения чистых культур микроорганизмов основаны
на изоляции одной микробной клетки от массы микроорганизмов
(их смешанной микрофлоры объекта и последующем выращивании
ее на питательных средах). Наиболее распространенный способ –
посев на плотные питательные среды в чашки Петри. Иногда культуру предварительно накапливают в специальных (элективных)
средах. Основная задача методов – разведение исследуемого материала с таким расчетом, чтобы выросли изолированные колонии
микроорганизмов.
121
Метод истощенного посева на поверхности плотной питательной
среды применяется для выделения аэробных и факультативно-анаэ-
робных микроорганизмов.
Включает следующие этапы:
– подписывают стерильные чашки Петри с заранее приготовленной питательной средой на крышках карандашом по стеклу (как
правило, указывают сокращенное название специальности (М),
номер подгруппы, номер варианта по журналу, номер разведения);
– в стерильных условиях на поверхность среды первой чашки
(первое разведение) бактериологической петлей наносят каплю
исследуемого материала;
– стерилизуют шпатель Дригальского обжигом в пламени со
спиртом;
– быстро, тщательно и равномерно растирают каплю на поверхности среды, не повреждая ее;
– не стерилизуя, шпатель Дригальского переносят во вторую
чашку (второе разведение) и растворяют остатки биологического
материала на поверхности питательной среды;
– аналогично делают посев в третью, червертую и последующие
чашки (количество разведений определяется степенью микробиологической загрязненности материала), при этом количество
высеваемого материала последовательно убывает.
Метод предварительного разведения исследуемого материала
в стерильной воде или физрастворе:
– готовят для разведения материала в 10, 100, 1000 и т. д. раз в зависимости от его обсемененности в пробирках со стерильной водой;
– вносят по 1 мл каждого разведения в заранее подписанные
стерильные чашки Петри пустые (глубинный посев) или со средой
(поверхностный посев);
– при глубинном посеве чашки Петри с внесенным материалом
заливают предварительно расплавленной и охлажденной до температуры 45–50
ремешивают содержимое чашки и оставляют для застывания среды;
– когда среда полностью застынет, чашки ставят в термостат
вверх дном при 30
°С средой, осторожно вращательным движением пе-
°С на трое суток.
122
Если необходимо выделить строгих анаэробов, то применяют
специальные среды (например, Китта–Тароцци) и условия выращивания (узкий столбик среды, сверху залитый парафином или
водным агаром).
Если разведение исследуемого материала выполнено правильно,
на поверхности среды и в ее толще образуются отдельные колонии
микроорганизмов, видимые невооруженным глазом. Исследуемую
культуру изолируют, т. е. пересевают на отдельную среду после
проверки на чистоту (визуально и микроскопированием мазка).
Метод пластинчатых разводок Коха:
– бактериологической петлей в стерильных условиях вносят
каплю исследуемого материала в пробирку с расплавленной средой
МПА при температуре 45–50
– закрыв пробирку пробкой, тщательно перемешивают содержимое путем вращения пробирки между ладонями;
– берут вторую пробирку со стерильной средой, в которую из
первой пробирки вносят необходимую аликвоту (определенный
объем), тщательно перемешивают содержимое, поставив первую
пробирку на водяную баню, чтобы среда не застыла;
– повторяют операцию последовательного разведения материала необходимое количество раз, после чего содержимое пробирок выливают в предварительно подписанные стерильные чашки
Петри.
Капельный метод (используется для выделения морфологически
крупных микроорганизмов, например дрожжей или плесеней):
– готовят взвесь микроорганизмов на специальных средах с
таким расчетом, чтобы в одной капле жидкости была одна клетка
(концентрация взвеси определяется экспериментально);
– на стерильное покровное стекло стерильным инструментом
наносят капли рядами по три-четыре капли в ряду, после чего накрывают предметным стеклом с лункой, предварительно смазанной
по краям вазелином;
– микроскопируют препарат, каплю с одной клеткой отмечают
тушью;
– препаратное стекло переносят в термостат;
°С;
123
– из помеченных капель, в которых произошло размножение,
производят пересев в жидкую питательную среду.
Выделение чистых культур крупных микроорганизмов можно
проводить также при помощи микроманипулятора – специального
прибора, позволяющего проводить очень тонкие и сложные операции под микроскопическим контролем с помощью микроигл,
микропипеток и др. инструментов.
Ход работы
Задание 1. Ознакомиться с методами выделения чистой культуры
микроорганизмов.
Задание 2. Освоить метод истощающего посева и предварительного разведения.
Задание 3. Провести посевы методом истощающего посева и
предварительного разведения на поверхность плотной питательной
среды.
Требования к оформлению отчета
Для получения зачета по данной работе необходимо предоставить конспект теоретического материала по предложенным заданиям и фото роста микроорганизмов в чашке Петри.
Вопросы для самоподготовки
1. Что такое чистая культура микроорганизмов? Что такое штамм?
2. Перечислите методы выделения чистых культур микроорганизмов.
3. Охарактеризуйте сущность посевов методом истощающего посева.
4. Каковы основные операции при посеве методом предварительного
разведения?
5. Охарактеризуйте сущность посевов методом пластинчатых разводок.
6. Для выделения каких микроорганимзмов используют капельный
метод?
7. Дайте описание последовательности выполнения посевов методами
истощающего посева, предварительного разведения, пластинчатых разводок, капельным методом.
8. Проведите сравнительный анализ используемых методов получения
чистой культуры микроорганизмов. Отметьте их положительные и отрицательные стороны.
124
Цель работы – ознакомиться с основными принципами составления питательных сред для культивирования микроорганизмов,
изучить потребности микроорганизмов в источниках питания.
Питательная среда обеспечивает жизнедеятельность, рост и
развитие микроорганизмов, эффективный синтез целевого продукта. Неотъемлемой частью питательной среды служит вода, все
процессы жизнедеятельности протекают только в водной среде.
Питательные среды могут иметь неопределенный состав, т. е.
включать биогенные добавки – мясной экстракт, кукурузную муку,
морские водоросли и т. д. Подобные среды обычно готовят на
водопроводной воде. Применяют также среды, приготовленные
из чистых химических соединений в заранее определенных соотношениях, – синтетические среды. Смесь веществ, как правило,
вносят в дистиллированную воду. С экономической точки зрения
выгодно употребление природного, более дешевого, сырья. Однако
применение синтетических сред позволяет изучить физиолого-биохимические свойства микроорганизмов и оптимизировать состав
среды. Компромиссным вариантом является использование полусинтетических сред, в состав которых вместе с химически чистыми
соединениями входят биологические добавки.
Состав среды определяется потребностями микроорганизмов в
соединениях, необходимых для биосинтеза и получения энергии.
Конструктивные и метаболические процессы у микроорганизмов
крайне разнообразны, поэтому столь же разнообразны их потребности в питательных веществах.
Питательные среды для культивирования микроорганизмов содержат большое количество необходимых компонентов, основным
из которых считают тот, который служит микроорганизмам источником углерода и энергии. Это вещество или смесь веществ называется
субстратом, а все остальные – вспомогательными веществами.
Так как микроорганизмы способны ассимилировать любое органическое соединение, потенциальными ресурсами для биотехнологии
125
могут служить все мировые запасы органических веществ. При
выборе сырья необходимо учитывать его влияние на себестоимость готового продукта, доступность, методы получения, свойства
и качественные характеристики.
Потребность микроорганизма в тех или иных соединениях определяется особенностями данного вида. В самом приближенном виде
физиологические потребности микроорганизмов в питательных
веществах можно выявить, определив химический состав микробной клетки: обычно содержимое углерода находится в пределах
45–55 %, азота – 6–14 %, К – 0,5–2 %, P – 1–3 %, Mg – 0,1–1 %,
S – 0,002–1 %, Са – 1 %.
Источники углерода. Легкодоступными считаются сахара: глюкоза, сахароза, лактоза. За ними следуют многоатомные спирты:
глицерин, маннит и др. Далее следуют полисахариды: целлюлоза,
гемицеллюлоза, крахмал, которые могут быть источниками углерода либо после превращения их в усвояемые микроорганизмами
моно- и низкомолекулярные олигосахариды, либо микроорганизмы
должны иметь набор ферментов, гидролизующих эти вещества
(Aspergillus, Bacillus, Penicillium и др.).
На практике встречается большое количество микроорганизмов,
которые успешно утилизируют органические кислоты, особенно
в анаэробных условиях.
Низкомолекулярные спирты метанол и этанол относятся к числу перспективных видов сырья. Многие дрожжи родов Candida,
Hansenula и др. способны ассимилировать этанол. Дрожжи родов
Pichia, Candida и бактерии рода Flavobacterium используют в качестве
единственного источника углерода метанол.
Некоторые виды микроорганизмов используют в качестве источника углерода и энергии n-алканы и некоторые фракции нефти.
Особенностью углеродов являются их низкая растворимость в воде.
Поэтому только незначительная часть микроорганизмов способна
ассимилировать углерод.
Источники азота. Азот может содержаться в форме неорганических солей или кислот. Большинство дрожжей хорошо усваивает
аммиачные соли, а также аммиак из водного раствора, потребность
126
в нитратах испытывают только некоторые виды дрожжей. Источником азота могут служить и органические соединения: аминокислоты, мочевина и т. д., которые легко усваиваются микроорганизмами.
Известно, что бактерии более требовательны к источникам азо-
та, чем грибы, актиномицеты и дрожжи.
Источники фосфора. Фосфор является важнейшим компонентом клетки, он входит в состав аденозинтрифосфата (АТФ),
аденозиндифосфата (АДФ), аденозинмонофосфата (АМФ) и обеспечивает нормальное течение энергетического обмена в клетке, а
также синтез белков, нуклеиновых кислот и других биохимических
превращений. Фосфор вносится в среду в виде фосфорной кислоты.
Вода. Вода должна отвечать требованиям СанПиН 2.1.4.1074-01
(чистая, бесцветная, без привкуса, запаха и осадка).
Источники витаминов и микроэлементов. Потребность у микроорганизмов в этих соединениях различна, тем не менее практически все микроорганизмы лучше растут в присутствии витаминов.
Эффективной добавкой для питательных сред оказался кукурузный
экстракт благодаря наличию в нем витаминов, аминокислот и минеральных элементов в легко ассимилируемых формах. В рецептуры
сред включают также дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт,
сок картофеля, молочную сыворотку, экстракт солодовых ростков
и других продуктов.
Микроэлементы в состав питательных сред вводят в микродозах, в противном случае они оказывают ингибирующее действие
на микроорганизмы.
Состав питательной среды для каждого микроорганизма устанавливают экспериментально. Задача специалиста, оптимизирующего
состав среды для конкретного вида микроорганизма, – выбрать такие источники углерода, азота, фосфора и др. веществ, которые наиболее оправданны в экономическом и экологическом отношениях.
Ход работы
Задание 1. Изучить потребности микроорганизмов в источниках
питания.
Задание 2. Провести подготовку и засев питательной среды культурой продуцента.
127
2.1. Приготовление питательной среды. Среду заданного состава
готовят в колбах на 250 см
3
(табл. 11).
Все компоненты растворяют в небольшом количестве водопро-
водной воды, затем объем доводят до 100 см
3
водопроводной водой.
Колбы со средой закрывают ватными пробками.
2.2. Определение рН питательной среды. В стеклянный стаканчик
отбирают 25 см
3
содержимого каждой из колб и с помощью ионо-
мера определяют рН среды.
2.3. Определение содержания сухих веществ в питательной среде.
Определение проводят с помощью рефрактометра. Перед началом
работы рефрактометр проверяют с помощью дистиллированной
воды, при этом пунктирная линия, нанесенная на окуляр, должна
совместиться с границей света и тени на нулевой отметке шкалы,
значение при этом составляет 1,333.
Таблица 11
Компоненты, на
100 см3 среды
1 2 3 4 5 6
Вариант
Сахароза, г – 3 – – – –
Глюкоза, г 3 – – 3 6 3
Лактоза, г – – 3 – – –
NaNO
р-р), см
КН
р-р), см
КСl (5%-ный р-р),
см
MgSO
(1%-ный р-р), см
FeSO
(1%-ный р-р), см
СаО (10%-ный
р-р), см
(20%-ный
3
2РО4
3
⋅ 7H2O
4
⋅ 7H2O
4
3
(10%-ный
3
3
5 5 5 5 10 5
2 2 2 2 4 2
1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 2 1
3
1 1 1 1 2 1
3
0,3 0,3 0,3 0,3 0,6 0,3
Витамины – – – + – –
рН 6,5–6,8 6,5–6,8 6,5–6,8 6,5–6,8 6,5–6,8 4
128
Затем на призмы с помощью стеклянной палочки наносят несколько капель исследуемой жидкости. Верхнюю призму опускают
и плотно прижимают к нижней. После этого перемещают окуляр вдоль прорези, пока граница света и тени не совместится с
пунктирной линией. По шкале прибора отмечают деление, через
которое проходит граница светотени. После определения поверхность призмы протирают фильтровальной бумагой и промывают
дистиллированной водой.
2.4. Подготовка посевной суспензии питательной среды. Для по-
лучения посевной суспензии в пробирку с чистой культурой гри-
3
ба-продуцента вблизи пламени спиртовки наливают 9 см
стерильной воды. Бактериологической петлей осторожно соскребают слой,
содержащий споры, до образования суспензии.
Засев питательной среды производят стерильными пипетками.
3
Из пробирки отбирают по 1 см
суспензии и количественно переносят в каждую колбу с питательной средой. Колбы закрывают
ватными пробками.
2.5. Установка колбы в термостат. Каждую колбу подписывают
и устанавливают в термостат на семь суток при температуре 27
°С.
Задание 3. Провести сравнительный анализ влияния компонентного состава среды на интенсивность роста и биомассу
микроорганизма.
3.1. Отделение биомассы гриба. На аналитических весах взвеши-
вают пустые бумажные фильтры, предварительно высушенные до
постоянной массы (вес записывают), и вставляют в воронки. Колбу
отмывают, содержимое фильтруют. Отделенная от культуральной
жидкости биомасса гриба является материалом для определения
массы сухого мицелия. После фильтрования определяют массу сухого мицелия. После фильтрования замеряют объем культуральной
жидкости и доводят до 100 мл дистиллированной водой.
3.2. Определение массы сухого мицелия. Фильтры с биомассой гри-
ба помещают в сушильный шкаф при температуре 130
°С на 40 мин
(до полного высушивания). Затем фильтры переносят в эксикатор
для охлаждения на 10–15 мин, после чего взвешивают на аналитических весах. Разность между массой фильтра с сухим мицелием
129
и массой пустого фильтра является массой сухого мицелия (х),
,xM M= −
мф
0
xx
SS
−
0
x
SS
21
xx
tt
−
образовавшегося за период культивирования гриба в термостате:
где х – масса сухого мицелия, г; Мм – масса фильтра с высушенным
мицелием, г; М
– масса пустого фильтра, г.
ф
3.3. Определение содержания сухих веществ в культуральной жид-
кости проводят с помощью рефрактометра.
3.4. Определение рН в культуральной жидкости определяют с по-
мощью иономера.
3.5. Расчет показателей процесса культивирования. Отношение
прироста биомассы гриба к количеству потребленного субстрата
называют экономическим коэффициентом.
На основании полученных данных для каждого варианта рас-
считывают экономический коэффициент (Y) по формуле
0
Y
=
,
−
где Y – экономический коэффициент; х – масса сухого мицелия,
г; х
– масса посевного материала, г; S – концентрация сухих ве-
0
ществ в питательной среде, %; S
– концентрация сухих веществ
0
в культуральной жидкости, %.
Так как х
часто бывает очень мала, то
0
Y
=
.
−
Таким образом, экономический коэффициент, или выход био-
массы, показывает массу клеток продуцента на единицу субстрата.
Общая скорость роста микроорганизма-продуцента (V) харак-
теризуется абсолютным приростом биомассы за единицу времени:
0
V
=
,
−
где V – общая скорость роста, г/сут; х – конечная концентрация
биомассы, г; х
– масса посевного материала, г; t2 – t1 – время
0
культивирования, сут.
130
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]