Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Применение бактериальных заквасок, стартовых культур и биопрепаратов. Учебно-методическое пособие
.pdf
нулевого, четвертого и пятого разведения в стерильное обезжиренное молоко.
Посевы термостатируют в течение 72 ч. Из сгустков готовят
микроскопические препараты, просматривают их и определяют
наличие или отсутствие посторонних микроорганизмов. Посторонняя микрофлора не должна обнаруживаться при посеве 1 см
закваски.
Наличие БГКП в закваске определяют посевом закваски на среду
Кесслера. Закваску предварительно нейтрализуют до рН 7,4–7,6, добавляя к 10 см
термостатируют при 37
3
закваски 1 см3 10 % раствора питьевой соды. Посевы
°С в течение 24 ч. Результаты оценивают по
образованию или отсутствию газа. БГКП должны отсутствовать при
посеве 3 см
3
закваски для кефира и 10 см3 закваски для остальных
продуктов. Анализ на наличие БГКП производят из каждой емкости
закваски ежедневно.
Определение наличия диацетила, ацетоина и углекислоты про-
изводят в заквасках для масла и сыра.
Содержание диацетила и ацетоина определяют по креатиновой
пробе. На белую фарфоровую пластинку наносят в равных объемах (по 1 капле) фильтрованную закваску, 40%-ный раствор КОН
и 0,04%-ный раствор креатина, тщательно перемешивают.
Отмечают время появления розового окрашивания. Если порозовение произошло менее чем за 7 мин, то закваска считается
хорошим продуцентом диацетила и ацетоина. Если же появление
розового окрашивания отмечается после 7–10 мин, то это указывает на слабую ароматобразующую способность микроорганизмов.
Наличие углекислого газа в закваске устанавливают, наливая в
пробирку диаметром 15 мм закваску (20 см
3
), отмечают ее уровень
и ставят на водяную баню с холодной водой. Температуру воды
доводят до 90
°С и, не вынимая пробирку, отмечают уровень. Если
закваска содержит углекислый газ, то сгусток становится губчатым
и поднимается над сывороткой от 0,6 до 5 см и более.
Состав микрофлоры кефирной закваски (производственной
и грибковой) определяют методом предельных разведений путем
посева различных разведений в стерильное обезжиренное молоко
и культивирования их в течение трех суток. Далее микроскопируют
3
91
препараты, приготовленные из содержимого пробирок со свернувшимся молоком.
Ароматобразующие молочнокислые стрептококки выявляют на
плотной среде с цитратом кальция при посеве различных разведений закваски. Посевы культивируют при 26
суток. Затем учитывают колонии, образующие зоны просветления
в данной среде.
Дрожжи определяют путем посева различных разведений закваски в чашки Петри и последующем выращивании при 24
в течение трех-пяти суток.
Уксуснокислые бактерии определяют методом предельных разведений путем посева в стерильное обезжиренное молоко и термостатируют их при 30
бактерий судят по желтому кольцу, образующемуся на поверхности
свернувшегося молока.
Наличие бактериофага устанавливают посевом закваски в стерильное обезжиренное молоко с добавлением раствора метиленового синего. Если в процесс культивирования после обесцвечивания метиленового синего через 4–5 ч снова наблюдается посинение
молока, то это указывает на наличие в закваске бактериофага.
Установление причин нарушения процесса сквашивания. Основной причиной нарушения этого процесса является наличие
в молоке ингибирующих веществ или бактериофага.
Для выявления причин несквашивания наблюдают за развитием
молочнокислых стрептококков в молоке в первые часы после внесения закваски. Если в молоке содержатся ингибирующие вещества,
то развитие микроорганимов закваски не наблюдается с самого
момента заквашивания. Если же причиной несквашивания является
развитие бактериофага, то сначала наблюдается увеличение количества клеток, а через 2–3 ч – их исчезновение в результате лизиса.
Органолептические показатели. Качество каждой партии закваски перед выдачей в цех оценивают по органолептическим
показателям: вкусу и запаху, характеру сгустка и консистенции закваски. Закваска должна иметь ровный плотный сгусток, требуемую
для данного продукта консистенцию, чистый кисломолочный вкус
и выраженный аромат.
°С в течение трех-пяти суток. О наличии
°С в течение трех-пяти
°С
92
Контрольные вопросы
1. По каким критериям классифицируют бактериальные закваски (БЗ)
и бактериальные концентраты (БК) согласно ГОСТ 34372-2017?
2. Какие группы БК и БЗ выделяют в зависимости от физического
состояния?
3. На какие группы подразделяют потребительские закваски?
4. Какие группы заквасок для молочной промышленности выделяют
по природе микроорганизмов, входящих в их состав?
5. Дайте определение понятию «стартовые культуры», что собой пред-
ставляют стартовые культуры для производства заквасок?
6. Каковы направления использования стартовых культур?
7. Какие микроорганизмы используют в составе стартовых культур для
ферментации колбас?
8. Охарактеризуйте основные биохимические процессы при фермен-
тации колбас стартовыми культурами.
9. Каковы преимущества и недостатки применения стартовых культур
для ферментации колбас?
10. Опишите основные технологические процессы, которые используют
при ферментации колбас.
11. Какие требования предъявляют к работникам, условиям их работы
в лаборатории специализирующейся на приготовлении заквасок?
12. Какие требования предъявляют к молоку, которое используют для
приготовления заквасок?
13. Какие основные технологические операции приготовления заквасок
используют на производстве?
14. Что собой представляет активация чистых культур заквасочной
микрофлоры?
15. В чем отличие заквасок прямого внесения и заквасок, получаемых
пересадочным способом?
16. Чем отличается лабораторная и производственная закваски?
17. По каким основным параметрам контролируют качество заквасок?
18. Какие биологические препараты готовят в специальных лабора-
ториях?
19. Какие виды бактериальных концентратов чаще всего вырабатывают?
20. Назовите основные этапы приготовления сухого бактериального
концентрата.
21. Каковы условия приготовления жидких заквасок?
22. Какие этапы включает процесс получения натуральных кефирных
грибков?
23. Каковы условия и методы приготовления заквасок на производстве?
24. Каковы основные требования по использованию заквасок после
получения их в лаборатории?
93
25. В чем отличие пересадочного и беспересадочного методов приго-
товления заквасок?
26. Что такое материнская закваска?
27. Какие среды используют для восстановления активности кефирных
грибков?
28. Перечислите и охарактеризуйте основные стадии восстановления
кефирной закваски.
29. Какие микроорганизмы входят в состав хлебной закваски?
30. Какова биотехнологическая роль хлебной закваски?
31. Какие виды брожения преобладают в хлебных заквасках?
32. Каковы причины снижения активности заквасок?
33. Следствием нарушения каких технологических процессов является
появление в заквасках БГКП?
34. Каковы причины возникновения излишней кислотности заквасок?
35. Каковы причины возникновения вспучивания заквасок, какие
меры необходимы для устранения этого порока?
36. Каковы причины возникновения ослизнения заквасок, какие меры
необходимо предпринимать для устранения этого порока?
37. Какие меры микробиологического контроля используют для опре-
деления эффективности пастеризации молока для производства заквасок?
38. По каким параметрам контролируют качество маточной и произ-
водственной заквасок?
39. По каким параметрам контролируют активность и чистоту заквасок?
40. Наличие каких микроорганизмов определяют по креатиновой пробе?
41. Какими методами определяют ароматообразующие молочнокислые
стрептококки, дрожжи и уксуснокислые бактерии?
Цель работы – ознакомиться с основными видами и принципами
составления питательных сред для культивирования микроорганизмов.
Основные требования, предъявляемые к питательным средам
Для выделения чистых культур микроорганизмов, их размножения в лабораторных условиях, санитарно-бактериологических
94
исследований объектов внешней среды, микробиологических исследований молока и молочных продуктов на питательных средах
культивируют микроорганизмы. Необходимые для питания микроорганизмов вещества весьма разнообразны: в питательной среде
обязательно должны присутствовать источники органогенов – О,
Н, С, N; зольные элементы – Р, К, Са, Na, Mg, Fe, S. Многие микроорганизмы нуждаются в определенных микроэлементах, в том
числе Мn, Zn, Mo, Co, C и др.
Для роста молочнокислых бактерий и БГКП необходимы еще
ростовые вещества, которые по химическому составу и физиологическим свойствам являются витаминами или витаминоподобными
веществами, – биотин, холин, тиамин, никотиновая и пантотеновая
кислоты, рибофлавин и др.
Применяемая для культивирования микроорганизмов питательная среда должна отвечать следующим основным требованиям:
– содержать необходимые питательные вещества (источники
азота и углерода), минеральные соли, витамины группы В (росто-
вые вещества) в соответствии с типом питания микроорганизмов;
– достаточное количество воды, поскольку питание микробов
осуществляется путем диффузии и осмоса питательных веществ,
растворимых в воде;
– обладать изотоническим для микроорганизмов осмотическим
давлением;
– иметь определенную (оптимальную для той или иной группы
микробов) концентрацию водородных ионов (рН), так как микроорганизмы по-разному относятся к активной кислотности среды:
для большинства сапрофитных и патогенных бактерий оптимальным является рН 7,2–7,6, для уксуснокислых бактерий – рН 4–5,
для молочнокислых бактерий – рН 6,5–6,9;
– быть стерильной; желательно, чтобы среда была прозрачной,
позволяющей наблюдать за ростом микроорганизмов.
В качестве универсального источника азота для гетеротрофных
микроорганизмов используют пептоны – продукты распада мясных, молочных, рыбных белков. В них содержатся фосфор, сера и
основные минеральные вещества, а также органический углерод
95
и азот. В качестве универсального источника углерода в питательные среды вносят углеводы (сахара) – глюкозу, лактозу и др.
Классификация питательных сред
По составу среды для культивирования микроорганизмов делят
на две группы: натуральные (естественные) неопределенного состава
и синтетические.
Натуральными называют среды, в состав которых входят продукты растительного или животного происхождения: овощные,
фруктовые соки, молоко, отвары животных тканей, разведенная
кровь, настои или экстракты, полученные из природных субстратов.
Такие среды, как правило, содержат все компоненты, необходимые
для роста и развития клеток, поэтому на них микроорганизмы
растут хорошо. Вместе с тем такие среды не очень пригодны для
изучения физиологических особенностей и обмена веществ ми-
кроорганизмов, поскольку они имеют сложный и непостоянный
химический состав. Кроме того, в состав сред, содержащих компоненты растений или животных, могут попадать как стимуляторы,
так и ингибиторы роста клеток. Например, используя антибиотики
для профилактики заболеваний животных, можно предположить
их наличие в молоке, гормонов – в мясе. Примерами натуральных
сред неопределенного состава, которые широко применяются в
лабораторной практике, служат мясопептонный бульон (МПБ),
неохмеленное пивное сусло, дрожжевая и картофельная среды,
почвенная вытяжка, кукурузный экстракт.
Синтетическими, или искусственными, называют среды, в состав
которых входят только определенные химически чистые соединения,
взятые в точно указанных концентрациях. Эти среды наиболее удобны для изучения обмена веществ микроорганизмов. Синтетические
среды могут быть довольно простыми по составу, а могут иметь
достаточно большой набор компонентов. Зная точный состав и количество входящих в среду веществ, можно изучить их потребление
и проследить превращение в соответствующие продукты обмена.
В настоящее время разработаны и успешно используются в микробиологической практике синтетические среды, не уступающие
по своему составу натуральным.
96
По назначению различают элективные и дифференциально-диагностические (индикаторные) среды. Элективные среды обеспечивают преимущественно развитие одного вида или группы микроорганизмов, менее пригодны или даже совсем не пригодны для
развития других. Их применяют для выделения микроорганизмов из мест их естественного местообитания или для получения
накопительных культур. Изменяя компонентный состав среды,
ее активную кислотность, интенсивность аэрации, температуру
культивирования, можно создать условия, при которых будут развиваться лишь микроорганизмы определенной группы.
Индикаторные среды позволяют достаточно быстро отличить
один вид бактерий от другого. Эти среды применяются в клинической бактериологии, при генетических исследованиях, а также
для идентификации микроорганизмов. В лабораторной практике
наиболее часто применяют среды с содержанием различных углеводов и индикаторов, например среды Эндо, Левина, Плоскирева. Эти питательные среды служат для дифференциации БГКП
от сальмонелл. Дифференциация основана на способности БГКП
ферментировать лактозу с образованием молочной кислоты, которая закисляет среды и восстанавливает индикатор. Основными
компонентами этой среды являются питательный (пептонный)
агар-агар (агар), лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом (реактив Шиффа). Исходная питательная среда окрашена
в розовый цвет. Микроорганизмы, не сбраживающие лактозу, образуют бесцветные колонии.
На среде Эндо E. coli образует колонии красного цвета с металлическим блеском, на среде Плоскирева – колонии розового
цвета, а на среде Левина кишечная палочка образует синие или
черные колонии. Салмонеллы лактозу не ферментируют, поэтому
на указанных средах образуют бесцветные колонии.
По физическому состоянию или консистенции различают жидкие,
плотные и сыпучие среды. Жидкие среды применяются для выяснения физиолого-биологических особенностей микроорганизмов,
накопления биомассы или продуктов обмена; плотные среды – для
выделения чистых культур (получения изолированных колоний),
97
хранения культур, количественного учета микроорганизмов и
т. д. Сыпучие среды (разваренное пшено, отруби, кварцевый песок,
пропитанные питательным раствором) – в микробиологической
промышленности.
Рост бактерий в жидкой питательной среде мы можем определить
по косвенным признакам – изменению цвета среды, газообразованию, появлению мути или образованию пленки на поверхности,
но количественно определить, сколько в среде микроорганизмов,
мы не можем.
Для количественного учета микроорганизмов используют плотные питательные среды. Для уплотнения сред используют агар-агар,
желатин, кремнекислый гель (селикагель). Чаще всего в микробиологии используют агар-агар. Это сложный полисахарид, получаемый из некоторых морских водорослей. Микроорганизмы не
имеют ферментов для его расщепления и поэтому не используют его
в качестве питательного субстрата, вследствие чего среда остается
всегда твердой. В воде агар-агар образует гели, плавящиеся при
100
°С, а затвердевающие при 40 °С. Чаще всего агар-агар добавляют
к средам в количестве 2 %, но возможно и увеличение концентрации. Питательную среду с внесенным в нее агаром, нагревают на
кипящей водяной бане до полного расплавления агара, разливают
по колбам и стерилизуют.
Необходимо отметить, что в кислой среде (рН ниже 5,5) агар-агар
при стерилизации частично гидролизуется и поэтому после стерилизации не застывает. В этом случае агар-агар следует стерилизовать отдельно от среды в определенном объеме воды и добавлять в
среду после стерилизации. Для этого стерильный водный агар-агар
расплавляют на водяной бане и добавляют при постоянном перемешивании к стерильной, предварительно подогретой среде.
Если необходимо выращивать микроорганизмы на скошенной
агаризованной среде в пробирках, то расплавленную агаризованную среду разливают в пробирки (до
1
/3 их высоты), которые со
средой стерилизуют, а затем «скашивают». Для этого пробирки с
расплавленной средой устанавливают в наклонном положении и
дают среде застыть. Расстояние от среды до ватной пробки должно
составлять не менее 5–6 см.
98
Среду, предназначенную для выращивания микроорганизмов
в чашках Петри, стерилизуют, а затем в асептических условиях
(в боксе, ламинарном шкафу или около спиртовки) разливают
в стерильные чашки по 15–20 мл.
Желатин – это белок, получаемый при вываривании костей и
хрящей животных. Желатиновый гель плавится при температуре
23–26
многих микроорганизмов: 30–37
°С (эта температура ниже температуры культивирования
°С). Кроме того, желатин разжижа-
ется протеолитическими ферментами, выделяемыми некоторыми
микроорганизмами в среду. Эти свойства желатина ограничивают
его применение в качестве уплотнителя сред.
Желатин добавляют к жидким питательным средам в количестве
10–15 %. Ее используют главным образом для выявления протеолитической активности микроорганизмов.
При приготовлении сред важно учитывать требования микроорганизмов к кислотности среды. Для каждого микроорганизма
имеется своя оптимальная зона рН, в пределах которой он может
нормально развиваться. Многие бактериальные формы хорошо
развиваются в нейтральной среде (рН = 7,0), грибы размножаются в слабокислых условиях, а, например, бактерии, разлагающие
мочевину, – в щелочных. Поэтому, приготовив среду, проверяют
значение рН и, если необходимо, доводят это значение до нужной
величины растворами кислот (HCl, H
, молочной) или щелочей
2SO4
(NaOH, KOH).
Жидкие молочные питательные среды
К жидким молочным питательным средам относятся цельное
молоко, обезжиренное молоко и гидролизованное молоко.
Цельное молоко (кислотность 18
°Т) стерилизуют в течение 10
мин при давлении 0,1 МПа. Его используют для изучения физиологических свойств микроорганизмов. Смотрят интенсивность
свертывания молока, характер сгустка, кислотность. Кроме этого,
его используют для количественного учета маслянокислых бакте-
рий и приготовления заквасок.
Обезжиренное стерильное молоко стерилизуют при тех же условиях, как и цельное молоко. Его используют также для изучения физиологических свойств микроорганизмов, выращивания
99
молочнокислых бактерий, количественного учета молочнокислых
бактерий, приготовления молочного агара и как сырье для получения гидролизованного молока.
Гидролизованное молоко готовят следующим образом. Обычное
или восстановленное обезжиренное молоко кипятят и охлаждают
до температуры 45
бавляют 0,5–1 г порошка панкреатина (порошок предварительно
разводят в небольшом количестве теплой воды) или 2–3 г поджелудочной железы, пропущенной несколько раз через мясорубку. Затем
к молоку добавляют 5 мл хлороформа. Колбу закрывают пробкой
и выдерживают при температуре 40
часы молоко несколько раз перемешивают. Пробку после встряхи-
вания несколько раз открывают для удаления паров хлороформа.
Через 18–24 ч колбу извлекают из термостата, гидролизованное
молоко фильтруют через бумажный фильтр, разводят в два-три раза
водой, устанавливают рН 6,1–8,1 и стерилизуют в течение 15 мин
при температуре 121
К плотным молочным питательным средам относятся молочный
агар, агар с гидролизованным молоком, плотная среда с гидролизованным молоком и мелом.
Агар с гидролизованным молоком представляет собой гидролизованное молоко (основа), к которому добавляют 1,5–2 % агара,
стерилизуют в течение 15 мин при избыточном давлении 0,1 МПа.
Его используют для выделения чистых культур молочнокислых
бактерий и для изучения их культуральных свойств.
Агар с гидролизованным молоком и мелом готовят следующим
образом. 2–3 % мела в виде тонкого порошка добавляют к 2%-ному
агару, приготовленному на гидролизованном молоке, и стерилизуют
в течение 15 мин при давлении 0,1 МПа. Его используют для количественного учета молочнокислых бактерий в молоке и молочных
продуктах.
Молочный агар готовят внесением 20–30 % горячего стериль-
ного обезжиренного молока в стерильный расплавленный 2%-ный
водный раствор агара и тщательным перемешиванием составных
частей. Молочный агар используют для количественного учета
°С. Устанавливают рН 6,7–8,7. К 1 л молока до-
°С в течение 18–24 ч. В первые
°С.
100
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]