Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Применение бактериальных заквасок, стартовых культур и биопрепаратов. Учебно-методическое пособие
.pdf
протеолитических (гнилостных) и пептонизирующих бактерий
(микрококков).
К питательным средам для культивирования дрожжей и плесеней
относятся ростковая среда, сусло-агар, среда Сабуро.
Среда для обнаружения кишечных палочек в молоке и молочных продуктах. Применяют среду Кесслера (модифицированную),
которую готовят следующим образом. К 1 л водопроводной воды
добавляют 10 г пептона и 50 мл желчи (бычья или других сельскохозяйственных животных), кипятят смесь в течение 20–30 мин
на водяной бане при перемешивании и фильтруют ее через вату.
В полученном фильтре растворяют 2, 5 г глюкозы и доводят объем
смеси водопроводной водой до 1 л, устанавливают реакцию среды
(рН 7,4–7,6), после чего добавляют 2 мл 1%-ного водного раствора
кристаллического фиолетового, среду разливают в пробирки (по
5 мл) или колбы (по 50 мл) с поплавками и стерилизуют в течение 10 мин при температуре 121
°С. Готовая среда должна иметь
темно-фиолетовый цвет. Желчь и кристаллический фиолетовый
являются ингибиторами молочнокислых бактерий, подавляя их,
облегчают обнаружение кишечных палочек.
К средам, которые используют для идентификации бактерий группы кишечных палочек относятся среда Эндо, цитратная среда Козера.
Среда Эндо – к 100 мл расплавленного 3%-ного мясопептонного
агара (рН 7,6–7,8), соблюдая стерильность, добавляют 1 г лактозы,
растворенной в 5 мл стерильной воды и подогретой на водяной базе
при температуре 100
°С в течение 5 мин. В отдельную пробирку
наливают 0,6 мл отфильтрованного 10%-ного спиртового раствора
основного фуксина, к которому добавляют свежеприготовленный
20%-ный раствор (водный) сернистокислого натрия (Na
О) до получения бледно-розового окрашивания.
× 7Н
2
2SO3
×
Полученную таким образом смесь добавляют осторожно в рас-
плавленный лактозный агар и разливают в чашки Петри. Для выращивания бактерий необходимо использовать свежеприготовленную
среду Эндо.
На среде Эндо БГКП, сбраживающие лактозу, образуют колонии темно-красного до розового цвета, а патогенные бактерии
(возбудители кишечных инфекций), не сбраживающие лактозу,
101
образуют бесцветные колонии. Во избежание покраснения среды
ее защищают от света.
Цитратная среда Козера (модифицированная) применяется для
идентификации кишечных палочек. В 1 л дистиллированной воды
растворяют 1,5 г фосфорнокислого натрий-аммония, 1 г фосфорнокислого однозамещенного калия, 0,2 г сернокислого магния,
2,5–3 г натрия лимоннокислого, рН среды 6,8–6,9. Среду стерилизуют в автоклаве в течение 15 мин при давлении 0,1 МПа.
Затем стерильно добавляют к нему 10 мл 0,5%-ного спирто-
вого раствора бромтимолового синего и разливают в стерильные
пробирки. Цвет среды после добавления индикатора получается
изумрудно-зеленый.
Задание 1. Ознакомиться с классификацией питательных сред и
основными требованиями, предъявляемыми к питательным средам
для культивирования микроорганизмов.
Задание 2. Ознакомиться с основными видами питательных сред
и их назначением.
Задание 3. Изучив теоретический материал и литературу, заполните табл. 8.
Таблица 8
№
п/п
1 Сыворотка крови
2 Мясной бульон
3 Сусло-агар (СА)
4 Агар
5 Желатин
6 Среда Козера
7 Среда Чапека с витаминами
8 Сульфат аммония
9 Картофельно-глюкозный агар
10 Среда Эндо
11 Мясопептонный агар (МПА)
102
Питательная среда или
компонент питательной среды
Назначение питательной среды
или компонента
Окончание табл. 8
№
п/п
12 Селективный бульон Дойла
13 Среда мясопептонного желатина
14 Среда Плоскирева
15 Среда Левина
16 Среда Кесслера
17 Среда Сабуро
18 Цитратная среда Козера
19 Агар с гидролизованным
20 Обезжиренное молоко
Питательная среда или
компонент питательной среды
(модифицированная)
молоком и мелом
Назначение питательной среды
или компонента
Требования к оформлению отчета
Для получения зачета по данной практической работе необходимо выполнить задания и предоставить конспект теоретического
материала по предложенным заданиям и заполненную табл. 8.
Вопросы для самоподготовки
1. Назовите требования, предъявляемые к питательным средам.
2. По каким признакам классифицируют питательные среды?
3. Дайте характеристику основным питательным средам, применяемым
в технологии микробного синтеза.
4. Каково назначение питательных сред?
5. Каковы правила приготовления питательных сред?
6. Каково назначение агара как компонента питательных сред?
Цель работы – ознакомиться с основными методами стерилизации в биотехнологической и микробиологической практике.
Основные методы стерилизации и биотехнологии
Асептика – средства по предотвращению попадания ми-
кроорганизмов из окружающей среды в организм человека при
103
лечебно-диагностических манипуляциях и в исследовательский материал и питательные среды в биотехнологических производствах.
Предполагается стерилизация инструментов, материалов, рук персонала и соблюдение санитарно-гигиенических правил и приемов
в работе (например, стерилизация инструментов, использование
халатов, перчаток и т. д.).
Антисептика — средства по уничтожению микроорганизмов,
которые способны вызывать заражение кожных и слизистых покровов. Для этого используются химические вещества – антисептики, оказывающие антимикробное действие: этиловый спирт
(70 %), спиртовой раствор йода (5 %), растворы хлорамина (0,5–
2 %), формалина (0,5–1 %), перманганата калия (0,1 %), растворы
метиленового синего или бриллиантового зеленого (1–2 %) и т. п.
(например, местная обработка йодом в хирургической терапии).
Дезинфекция – обеззараживание объектов окружающей среды с
помощью химических веществ: хлорная известь (0,1–10 %), хлорамин (0,5–5 %), фенол или карболовая кислота (3–5 %), лизол
(3–5 %) и т. д. (например, обработка предметов: полов, стен и т. п.,
включение бактерицидной лампы).
Стерилизация является одним из важнейших и необходимых
приемов в биотехнологической и микробиологической практике.
Культивирование организмов проводится обязательно в стерильных
условиях. Под стерилизацией или обеззараживанием понимают
полное уничтожение живых микроорганизмов и их покоящихся
форм (спор) в питательных средах, на посуде, сухих материалах,
инструментах и других предметах лабораторного оборудования.
По характеру действия методы стерилизации в биотехнологии делятся на физические, механические и химические.
Физические методы стерилизации – прокаливание в пламени;
стерилизация сухим жаром (горячим воздухом в сушильном шкафу); стерилизация кипячением; стерилизация насыщенным паром
под давлением (автоклавирование); дробная стерилизация (тиндализация), стерилизация ультрафиолетовым облучением.
Химические методы стерилизации – дезинфекция антисептиками.
Механический метод стерилизации – фильтрация с помощью
мембранных фильтров и фильтров Зейтца.
104
Возможность и целесообразность применения того или иного
способа определяется особенностями материала, подлежащего
стерилизации, его физическими и химическими свойствами, целью
исследования. Чаще всего в биотехнологии и микробиологической
практике применяется термическая стерилизация.
Стерилизация обжигом в пламени горелки. Небольшие стеклянные и металлические предметы (игла, петля, пинцет, скальпель,
палочки, шпатель) стерилизуют прокаливанием в пламени непосредственно перед использованием. Стерилизация достигается
обугливанием микроорганизмов, находящихся на их поверхностях.
Обжигом в пламени пользуются для стерилизации поверхности
ватных пробок, горла посуды.
Стерилизация в автоклаве паром под давлением. Самый надежный и универсальный метод стерилизации питательных сред и
материалов – стерилизация их насыщенным паром под давлением выше атмосферного. Повышенное давление пара создается в
специальных герметичных толстостенных аппаратах (автоклавах).
Предметы, подлежащие стерилизации в автоклаве, заворачивают в
бумагу. Полная стерилизация многих питательных сред обеспечивается нагреванием в течение 15–20 мин при 120
°С и избыточном
давлении 1 атм сред с углеводами – 15 мин при 0,5 атм, обеззараживание инфицированного материала проводят 20–25 мин при
давлении пара 1,5–2 атм (табл. 9).
Стерилизация кипячением. Это наиболее простой и доступный
способ уничтожения микроорганизмов. Режим стерилизации
Давление пара, атм
0 100 30–60 (дробно)
0,5 111 10–30
1 121 15–20
1,5 127 15–20
2 133 15
Температура,
°С
Таблица 9
Длительность стерилизации,
мин
105
обычно 100 °С, 40 мин. Так можно стерилизовать металлические
инструменты, предметные стекла, резиновые трубки. Надо всегда
помнить, что споры некоторых бактерий сохраняют жизнеспособность при кипячении. Рекомендуется стерилизацию кипячением
проводить в 2%-ном растворе карбоната натрия с целью смягчения
воды и увеличения температуры кипения.
Стерилизация сухим жаром (печь Пастера). Сухим жаром стерилизуют в основном стеклянную посуду. Чтобы избежать вторичной
контаминации простерилизованных предметов, их перед стерилизацией заворачивают в бумагу. Вынимать их из нее рекомендуется только перед работой. Метод предусматривает бактерицидное
действие нагретого воздуха до 165–180
Стерилизация текучим паром проводится в аппарате Коха. Аппарат Коха – это металлический полый цилиндр с двойным дном (это
пространство заполнено водой) и крышкой конической формы.
Стерилизуемый материал загружают в камеру аппарата неплотно,
чтобы обеспечить возможность наибольшего контакта его с паром.
Стерилизацию текучим паром проводят несколько раз, так как
однократное подогревание до температуры 100
полной стерильности. Такая стерилизация называется дробной.
Она применяется для сред, разрушающихся при температуре выше
°С. Обработку стерилизуемого материала текучим паром про-
100
водят в течение трех дней по 30 мин ежедневно.
Тиндализация – применяется для стерилизации сред, не выдерживающих действия температуры выше 100
аппарате Коха или автоклаве с незавинченной крышкой (стерилизация текучим паром) три раза в течение 30 мин с перерывом
в сутки. В промежутках между прогреваниями среды помещают в
термостат (t = 30
проводится при 56–58
Применяется для веществ, которые легко разрушаются (например,
сыворотка крови, растворы витаминов и т. п.).
Пастеризация. В основе пастеризации лежит нагревание жидкостей до температуры не выше 100
бесспоровых бактерий в жидкостях, которые теряют питательные
свойства при кипячении (молоко, пиво, вино и др.). Осуществляется
°С) для прорастания спор. Дробная стерилизация
°С в течение часа пять-шесть суток подряд.
°С.
°С не обеспечивает
°С. Обработку ведут в
°С. Цель ее – уничтожение
106
пастеризация нагреванием жидкостей при 60–65 °С в течение 15–30
мин, или при 70–80
охлаждением.
Бактерицидное ультрафиолетовое облучение. Предметы, изготовленные из термолабильных пластмасс (например, центрифужные
пробирки), стерилизуют ультрафиолетовыми лучами (длина волны
260–300 мкм) в специальных боксах. Время облучения устанавливают экспериментально. Оно зависит от мощности бактерицидной
лампы и расстояния между лампой и объектом.
Механическое фильтрование. Органические жидкости не выносят нагревания, их освобождают от бактерий, попуская через
стерильные мелкоячеистые фильтры. Эти фильтры задерживают микроорганизмы, их называют бактериальными фильтрами.
Широко применяются мембранные фильтры с различным диаметром пор. Применяются также фарфоровые (из кварцевого песка
и каолина), стеклянные и фильтры из диатомита или кизельгура.
Асбестовые фильтры выпускаются диаметром 35–140 мм, различают фильтрующие и стерилизующие марки. Мембранные фильтры из нитроклетчатки или ацетилцеллюлозы имеют номера 1–5,
соответственно размеры пор 350–1200 нм. Перед употреблением
мембранные фильтры стерилизуют кипячением или в автоклаве.
Фильтры помещают в дистиллированную воду и кипятят 30 мин.
Химическая стерилизация. Применяются химические дезинфицирующие вещества. Не имеет широкого применения в биотехнологических производствах.
°С в течение 5–15 мин с последующим быстрым
Задание 1. Изучить методы стерилизации в биотехнологическом
производстве.
Задание 2. Ознакомиться с основными характеристиками средств
и приемов обеспечения промышленной стерильности на биотехнологических предприятиях.
Задание 3. Проанализируйте материал инструментов и подберите
вид его обеззараживания (стерилизации). Выберите (подчеркните)
из предложенных видов обработки возможные и наиболее целесообразные методы (см. табл. 10).
107
Таблица 10
№ п/п Инструменты, посуда Возможный вид стерилизации
1 Резиновые пробки Автоклавирование.
Кипячение.
Сухой жар
2 Пластмассовые переходники Автоклавирование.
Кипячение.
Фламбирование
3 Микробиологическая петля Фламбирование.
Автоклавирование.
Сухой жар
4 Скальпель Фламбирование.
Автоклавирование.
Сухой жар
5 Пинцет Фламбирование.
Автоклавирование.
Сухой жар
6 Мембранные фильтры Автоклавирование – при 0,5 атм.
Пастеризация.
Кипячение не менее 40 мин
7 Чашки Петри стеклянные Сухой жар.
Автоклавиование.
Кипячение
8 Наконечники для дозатора (ав-
томатическая пипетка)
9 Центрифужные пробирки Стерилизация УФ-лучами.
10 Перчатки Автоклавирование.
Автоклавирование.
Кипячение.
Сухой жар.
Фламбирование
Кипячение.
Автоклавирование при 0,5 атм.
Сухой жар
Кипячение.
Сухой жар
108
Окончание табл. 10
№ п/п Инструменты, посуда Возможный вид стерилизации
11 Шланги (не из пластмассы) Автоклавирование.
Кипячение.
Сухой жар.
Химическая обработка
12 Пипетки градуированные
стеклянные
Автоклавирование.
Сухой жар.
Кипячение.
Химическая обработка
Требования к оформлению отчета
Для получения зачета по данной практической работе необходимо предоставить конспект теоретического материала по предложенным заданиям (1–2) и заполненную табл. 10.
Вопросы для самоподготовки
1. Какие физические методы стерилизации вы знаете?
2. Какие режимы пастеризации применяются в молочной промыш-
ленности?
3. Что такое тиндализация?
4. Какой вид стерилизации чаще всего применяется в биотехнологи-
ческом производстве, а какой редко? Почему?
5. В каких случаях применяют ультрафиолетовое облучение?
6. Какие виды химической стерилизации вы знаете?
7. Назовите виды физической стерилизации.
Цель занятия – освоить методы приготовления и особенности
исследования препаратов живых и фиксированных клеток.
Оборудование и материалы: биологические объекты, микроскоп,
предметные стекла, иммерсионное масло, бактериологические
109
петли, фильтровальная бумага, предметное стекло с лункой, покровные стекла, спиртовки, растворы основных красок: фуксин
Пфейффера, краска Грама, раствор Люголя, раствор метиленового
синего, вода дистиллированная, спирт 96 %.
Устройство микроскопа
Для изучения микроорганизмов пользуются оптическими приборами – микроскопами. Микроскопы, применяемые в лабораториях, бывают оптические (монокулярные, бинокулярные), люминесцентные, а также электронные.
Оптический микроскоп состоит, в свою очередь, из механической и оптической частей. Механическая часть состоит из штатива,
тубуса, предметного столика и винтов. Штатив включает основание,
которое служит опорой микроскопа, и тубусодержатель, используемый для крепления подвижного тубуса и в качестве ручки для
переноса микроскопа.
Тубус – это зрительная труба микроскопа. В верхнее отверстие
тубуса свободно вставляется окуляр, а на нижнем его конце находится вращающийся вокруг своей оси барабан револьвера, в который ввинчиваются объективы. Вращая барабан револьвера, можно
быстро центрировать объективы в процессе работы с микроскопом, т. е. ставить объективы в оптическую ось тубуса микроскопа.
На барабане револьвера напротив объектива имеется желобок,
в который входит ступица (пружинка), закрепляющая объектив в
центрированном положении. При попадании ступицы в желобок
ощущается щелчок, требуется некоторое усилие для выведения
револьвера из этого положения.
Предметный столик предназначен для размещения изучаемого
препарата. Препарат закрепляют имеющимися на столике пружинными клеммами. В центре предметного столика есть отверстие для
прохождения лучей света, освещающих препарат.
Предметный столик можно передвигать в двух взаимно перпендикулярных направлениях с помощью двух винтов, симметрично
расположенных на краях, или в разных направлениях посредством
боковых винтов. Вместе со столиком передвигается и препарат, что
позволяет рассматривать его в разных полях зрения.
110
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]