Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Применение бактериальных заквасок, стартовых культур и биопрепаратов. Учебно-методическое пособие
.pdf
Таблица 12
№
п/п
рН
до после до после
культивирования культивирования
Содержание сухих
веществ, %
Масса
сухого
мицелия,
г/100 мл
Эконо-
мический
коэффи-
циент
Общая
скорость
роста,
г/сут
Требования к оформлению отчета
1. Результаты, полученные в ходе выполнения работы, внести
в табл. 12.
2. На основании результатов экспериментов сделать вывод
о физиолого-биохимических особенностях гриба Aspergillus niger.
3. Основываясь на результатах процесса культивирования микроорганизма и расчете экономического коэффициента, выбрать
оптимальный состав среды.
Вопросы для самоконтроля
1. Что такое субстрат?
2. Какие источники питания используют в питательных средах?
3. Какие источники углерода используют в биотехнологическом
производстве?
4. Какие источники азота усиливают микроорганизмами?
5. Как фосфор вносится в питательные среды?
6. Каким образом в питательные среды вводят источники витаминов
и микроэлементов?
7. Как производится посев культуры микроскопического гриба?
8. Как определяют содержание сухих веществ в питательной среде?
9. Какими методами можно определить интенсивность роста микроорганизма?
10. Какие методы используют для определения количества клеток микроорганизмов или их биомассы?
11. Что такое экономический коэффициент? Что он показывает?
131
Цель работы – исследование процесса культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae верхового и низового брожения на
углеродсодержащих средах.
Брожение – одна из разновидностей биологического окисления
субстрата у гетеротрофных микробов с целью получения энергии,
когда акцептором электронов или атомов водорода является органическое вещество.
Возбудителями брожения могут быть дрожжи – сахаромицеты,
некоторые мицелиальные грибы (Aspergillusoryzae) и бактерии
(Erwinia amylovora, Sarcina ventricular, Zymomonas mobilis, Z. anaerobia).
Дрожжи лучше развиваются в кислой среде (рН 4–6) и выдерживают
до 15–17 % спирта в растворе.
Дрожжи верхового брожения находятся в верхних слоях сусла,
куда они поднимаются образующимся диоксидом углерода и пеной. Брожение идет с незначительным повышением температуры
(20–28
и оседают на дно бродильных емкостей. Через пять-семь дней
верховое брожение заканчивается.
виях и при более низкой температуре (6–12
протекает медленно (8–10 дней). Дрожжи вскоре оседают на дно
и образуют хлопьевидный осадок.
дов, принимающих участие в окислительно-восстановительных
процессах в клетках и переносе аминокислот через биологические
мембраны, глутатион, который является коферментом оксидоредуктаз.
ный. Активатором является его восстановленная форма. Активирующее действие этих соединений основано на том, что они восстанавливают дисульфидные связи фермента в сульфгидрильные,
необходимые для проявления ферментом своей каталитической
°С). Незадолго до конца брожения дрожжи образуют хлопья
Дрожжи низового брожения развиваются в анаэробных усло-
°С), поэтому процесс
Один из наиболее распространенных внутриклеточных пепти-
Глутатион может быть двух видов: окисленный и восстановлен-
132
активности, а сами при этом окисляются за счет превращения
сульфгидрильных связей в дисульфидные.
Восстановленный глутатион (HS-глутатион) может окисляться
в дисульфидную форму мягкими окислителями (например, йодом,
бромом), молекулярным кислородом в присутствии катализаторов,
а также дегидроаскорбиновой кислотой в присутствии фермента.
Окисленная форма глутатиона проевращается в востановленную
под действием сильных восстановителей или ферментов. Благодаря
своей способности подвергаться ферментативному окислению и
восстановлению глутатион служит биологическим переносчиком
водорода.
Содержание глутатиона в дрожжах доходит до 1 % на сухой вес
(влажность прессованных дрожжей составляет около 75 %). Живые
неповрежденные дрожжевые клетки при суспендировании в воде
практически не выделяют глутатион. Активно бродящие дрожжевые
клетки (при суспендировании дрожжей в растворе сахара) выделяют
в окружающую среду значительное количество глутатиона.
Ход работы
Исследования производят в двух вариантах: 1) «голодающие»
дрожжи – контроль; 2) «бродящие» дрожжи – опыт (два варианта).
Задание 1. Для проведения работы студенты разбиваются на
группы, каждая из которых выполняет один из вариантов опыта
(табл. 13).
Готовятся среды в соответствии с табл. 13.
Таблица 13
Состав инкубационной смеси
Вариант
опыта
Контроль 15 200 – –
1 15 100 100 –
2 15 70 100 30
Дрожжи
прессованные,
г
Вода,
см
3
сахарозы, см
10%-ный
раствор
70%-ный
раствор этилового
3
спирта, см
3
133
В первом варианте к суспензии дрожжей добавляется сахароза –
0,307 250.
= ⋅⋅
источник углеводного питания; во втором варианте – сахароза и
этиловый спирт в такой концентрации, которая вызывает нарушение физиологических процессов в дрожжевых клетках.
Навеску дрожжей вносят в стакан на 400–500 мл и добавляют
туда заданное количество воды, подогретой до 30
°С. Стеклянной
палочкой осторожно разминают комочки дрожжей и ставят стакан
в водяной термостат с мешалкой при температуре 30
°С.
Включают мешалку и добавляют в стакан остальные компоненты
инкубационной смеси, предварительно термостатированные при
°С. Через одну минуту, не останавливая мешалку, отбирают из
30
стакана пробу дрожжевой суспензии объемом 40 мл. Во время
отбора пробы интенсивность перемешивания должна быть достаточной для того, чтобы поддерживать однородность суспензии во
всем объеме жидкости. После отбора пробы мешалку выключают,
а дрожжевую суспензию оставляют в термостате.
Отобранную пробу центрифугируют и исследуют надосадочную
жидкость по следующим показателям: определение белка по Лоури,
определение глутатиона (используют 10 мл центрифугата), определение кислотности (титрование 10 мл центрифугата раствор 0,1 н
NaOH), определение рН (рН-метр или универсальная лакмусовая
бумага). В дальнейшем из каждой колбы отбирают по 40 мл однородной суспензии через 1, 2 и 3 ч после начала термостатирования.
Пробы центрифугируют и в центрифугате определяют перечисленные выше показатели.
Задание 2. Определение глутатиона йодометрическим методом
Реактивы: 5%-ный раствор метафосфорной кислоты; 1,5%-ный
раствор йодистого калия; раствор 0,001 н KJO
; 1%-ный раствор
3
крахмала.
Проведение анализа. Берут 10 мл центрифугата, добавляют 2 мл
5%-ной метафосфорной кислоты, 2 мл 1,5%-ного раствора йодистого
калия и несколько капель раствора крахмала. Титруют 0,001 н KJO
3
Расчет глутатиона проводят по формуле
.
0,307 – это титр раствора йодида калия по глутатиону.
134
WV
(GSH) (KJO )
3
Метод йодометрического титрования не является специфичным,
так как йодноватокислый калий окисляет не только глутатион, но и
сульфидные группы других соединений, в том числе сульфгидрильные группы белков. В данном случае подавляющее количество оттитрованных сульфгидрильных групп будет принадлежать глутатиону.
Задание 3. Определение белка по методу Лоури. Оно основано
на комбинации биуретового метода (образование окрашенного
комплекса пептидных связей с медью) и метода Фолина (образование окрашенного комплекса реактива Фолина с ароматическими
аминокислотами).
Метод Лоури имеет ряд преимуществ по сравнению с двумя
вышеназванными методами. Биуретовый метод малочувствителен;
окраска, развивающаяся при определении белка по методу Фолина,
сильно зависит от аминокислотного состава белка. Комбинированный метод Лоури в 100 раз чувствительнее биуретовой реакции,
точность определения мало зависит от состава белка. Метод прост
и удобен для серийных анализов.
Реактивы: А – 2%-ный раствор Na
0,5%-ный CuSO
⋅ 5H2O в 1%-ном растворе виннокислого натрия;
4
в 0,1 н NaOH; В –
2CO3
С – 50 мл А + 1 мл В (годен в течение одного дня); Д – разбавленный реактив Фолина (1:2).
Проведение анализа. Берут 0,4 мл испытуемого раствора белка
(50–500 мг) и 2 мл реактива С перемешивают и оставляют на 10
мин при комнатной температуре. Затем добавляют 0,2 мл реактива Д, очень быстро перемешивают (в течение 1–2 с) и оставляют
на 30–40 мин при комнатной температуре для развития окраски.
По истечении указанного времени интенсивность окраски образовавшегося комплекса измеряют на фотоэлектроколориметре (ФЭК)
при красном светофильтре или на спектрофотометре при длине волны 760 нм. Содержание белка определяют по калибровочной кривой.
Построение калибровочной кривой для определения белка по методу
Лоури
Реактивы: гемоглобин, альбумин или препарат другого стан-
дартного белка; реактивы, необходимые для определения белка по
методу Лоури; реактивы, необходимые для определения белка по
методу Кьельдаля.
135
Приготовление исходного раствора белка
Для построения калибровочной кривой необходимо использовать по возможности наиболее чистые и однородные препараты
белка, например кристаллические препараты гемоглобина, бычьего сывороточного альбумина и др. Желательно также, чтобы по
своей природе этот белок был бы достаточно близким к исследуемому белку. Для приготовления исходного раствора белка отвешивают на технических весах 0,1 г стандартного белка и растворяют
в 100 мл дистиллированной воды. При необходимости раствор
фильтруют.
Определение концентрации белка в исходном растворе. Точную
концентрацию приготовленного раствора устанавливают по методу Кьельдаля. Для этого берут на сжигание в колбы Кьельдаля
три пробы исходного белка по 0,1 г. При пересчете содержания
азота на белок используют универсальный белковый коэффициент
6,25. Установлено, что большинство растительных белков содержит
примерно 16 массовых процентов азота, поэтому коэффициент
пересчета общего азота на белок равен 100 : 16 = 6,25. Этот же коэффициент принят и для пересчета и определения сырого протеина
в микробиологическом производстве.
Содержание белка в исходном растворе рассчитывают как среднее арифметическое из трех параллельно полученных результатов.
1. Исходный раствор 100 единиц белка
2. 8 мл раствора 1 + 2 мл воды 80 единиц белка
3. 7 мл раствора 1 + 3 мл воды 70 единиц белка
4. 6 мл раствора 1 + 4 мл воды 60 единиц белка
5. 5 мл раствора 1 + 5 мл воды 50 единиц белка
6. 5 мл раствора 2 + 5 мл воды 40 единиц белка
7. 5 мл раствора 2 + 5 мл воды 35 единиц белка
8. 5 мл раствора 4 + 5 мл воды 30 единиц белка
9. 5 мл раствора 5 + 5 мл воды 25 единиц белка
10. 5 мл раствора 6 + 5 мл воды 20 единиц белка
11. 5 мл раствора 8 + 5 мл воды 15 единиц белка
12. 5 мл раствора 10 + 5 мл воды 10 единиц белка
13. 5 мл раствора 12 + 5 мл воды 5 единиц белка
136
Таблица 14
№
пробирки
Белок, усл. ед. Белок, мг/мл
Оптическая
плотность (А)
Примечание
При значительных отклонениях полученных данных расчет ведут
по данным двух наиболее близких результатов.
Приготовление растворов с меньшей концентрацией белка. Из исходного раствора методом разведения готовят растворы с меньшим
содержанием белка по приведенной схеме. Для этого установлено
принимают концентрацию исходного раствора белка за 100 усл. ед.
Определение белка по методу Лоури. Во всех приготовленных
растворах проводят определение по методу Лоури. В качестве контроля используют пробу, в которой вместо раствора белка берется
дистиллированная вода. По контрольной пробе настраивают прибор. Все результаты заносят в табл. 14.
Для получения надежных результатов работу дублируют несколько раз, поручая группе из двух-трех студентов построение
калибровочной кривой. При этом должны использоваться одни
и те же растворы белка, приготовленные для всей группы.
Построение калибровочного графика. По полученным данным
на миллиметровой бумаге строят калибровочный график с координатами «оптическая плотность – концентрация белка». При построении графика учитывают все полученные в работе результаты.
Калибровочный график используется для определения белка при
выполнении последующих работ.
Требования к оформлению отчета
1. По завершении эксперимента данные занести в табл. 15.
2. Построить графики по каждому исследуемому показателю
в зависимости от времени инкубации.
3. Сделать выводы по работе, сравнивая поведение дрожжей
в условиях «брожения» и «голодания».
137
Таблица 15
Варианты
опыта
«Голода-
ющие»
дрожжи
(контроль)
«Бродящие»
дрожжи
(опыт вари-
ант 1 и 2)
Время
инкубации,
ч
0
1
2
3
0
1
2
3
Белок
по Лоури,
мг/мл
Глутатион,
мг
Общая
кислотность,
0,1 н NaOH
Вопросы для самоконтроля
1. Охарактеризуйте сущность процесса брожения.
2. Перечислите возбудителей спиртового брожения.
3. На чем основано активирующее действие глутатиона?
4. Перечислите окислители и восстановители глутатиона.
5. Чем отличаются «голодающие» и «бродящие» дрожжи? Как можно
получить такие популяции клеток?
6. Какие соединения можно использовать в качестве источника угле-
рода для дрожжей?
7. Какие методы определения белка вы знаете?
8. На чем основано определение белка по Лоури?
9. Как изменяется кислотность среды во время инкубации дрожжей?
рН
Цель работы − ознакомиться с видовым составом и свойствами
заквасок для различных видов молочных продуктов.
При характеристике кисломолочных продуктов общее количество микроорганизмов, а именно количество мезофильных
аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) не определяется, так как в кисломолочных продуктах
всегда присутствует микрофлора закваски.
138
Для определения микрофлоры кисломолочных продуктов при-
меняется метод прямой микроскопии.
Микроскопия мазка, приготовленного из цельного или разведенного водой продукта, проводится с целью установления соответствия морфологически содержащихся в нем микроорганизмов
микрофлоре закваски, так как каждый кисломолочный продукт
имеет микрофлору определенного состава в основном из микроорганизмов закваски. Характеристики заквасок ферментированных
молочных продуктов представлены в табл. 16.
С помощью этого метода можно выявить присутствие посторонней микрофлоры и ее количественное соотношение, что дает возможность судить о качестве продукта. Для проведения исследования
из продукта готовят мазок, окрашивают метиленового синего 3–5
мин, затем мазок промывают водой, высушивают фильтровальной
бумагой и микроскопируют.
Ход работы
Задание 1. Приготовить окрашенные фиксированные препараты
различных заквасок;
Для приготовления препаратов из штаммов готовой закваски на
чистое предметное стекло наносят предварительно прокаленной
петлей небольшую каплю закваски и распределяют на площади
1–2 см², стараясь сделать мазок возможно более тонким. Препарат
высушивают на воздухе или при слабом нагревании над пламенем
горелки. Далее проводят окрашивание спиртоводным раствором
метиленового синего. Фиксированный мазок заливают краской
и выдерживают 0,5–1 мин. После окрашивания смывают краску
водой, фильтровальной бумагой удаляют с препарата основную
часть воды и окончательно высушивают его над пламенем горелки.
Задание 2. Провести микроскопическое исследование с помощью иммерсионного объектива.
Задание 3. Описать формы микроорганизмов закваски, исследуя
десять полей зрения.
Задание 4. Зарисовать микроскопическую картину препаратов
заквасок при увеличении в 100 раз.
139
Таблица 16
показатели
Органолептические
картина
Вкус чистый,
кисломолочный; слабый
аромат диацетила; сгусток
плотный; допускается
слабое отделение
сыворотки
Вкус чистый,
кисломолочный; слабый
аромат диацетила; сгусток
плотный; допускается
слабое отделение
сыворотки
Вкус чистый,
кисломолочный; слабый
аромат диацетила; сгусток
плотный; консистенция
однородная, слабовязкая,
без отделения сыворотки
Микроскопическая
Титруемая
Температура
Состав микрофлоры
кислотность,
сквашивания
закваски
Продукт
°Т
°С
молока,
цепочки кокков
разной длины,
28±2 80–90 Диплококки и
lactis (преобладают),
Lac. lactis ssp. diacetylactis
Творог Lactococcus lactis ssp.
встречаются от-
дельные кокки
цепочки кокков
разной длины,
24±2 80–90 Диплококки и
Lac. lactis, Lac.
diacetylactis, Lac.
Творог Закваска «Каунасская»:
встречаются
отдельные кокки
lactis ssp. cremoris
(преобладают)
цепочки кокков
разной длины,
26±4 80–90 Диплококки и
(преобладают), Lac.
lactis, Lac. diacetylactis
Сметана Lac. cremoris
встречаются
отдельные кокки
140
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]