Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Основы промышленной биотехнологии. Учебное пособие

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

07.09.2026

Размер:

2 Мб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 5 6 7 89 / 179 10 11 12 13 14 15 16 17 > Следующая >>>

Трансформация(превращение, перестройка) – это изменение генома бактерии-реципиента под влияние поглощенной из среды свободной ДНК, выделенной из бактерии-донора. Трансформацию может осуществлять только ДНК, включившаяся в геном реципиента. Ее источником могут быть свежеубитые бактерии или чистые препараты, экстрагированные из бактерий. Поэтому для получения трансформантов реципиентные бактерии выращивают на средах, содержащих чистую ДНК или убитые клетки доноров.

Трансформация была открыта в 1928 г. английским ученым Гриффитсом. Он установил превращение бескапсульного пневмококка R-типа в капсульный вирулентный S-тип. Заражая мышей смешанной взвесью живых бескапсульных авирулентных пневмококков и убитых нагреванием капсульных вирулентных пневмококков, Гриффитс наблюдал гибель животных, из крови которых выделял наряду с бескапсульными и капсульные пневмококки. Автор пришел к заключению, что бескапсульные варианты приобрели способность образовывать капсулу под влиянием капсульных пневмококков, несмотря на то, что последние были мертвыми. Однако природу трансформирующего вещества Гриффитс не установил. Он считал, что ответственными за образование капсулы являются полисахариды капсульных пневмококков S-типа.

Хотя трансформацию бескапсульных пневмококков наблюдали многие исследователи, природа трансформирующего агента оставалась неизвестной. И только в 1944 г. Эвери с сотрудниками выделил трансформирующее вещество из капсульных убитых пневмококков и иссле-довал его свойства. Оно оказалось чувствительным к ДНК-азе. Применение высокоочищенного препарата ДНК-азы показало, что он подавляет активность трансформирующего вещества. Это явилось неоспоримым фактом того, что трансформацию вызывает ДНК.

Установление трансформирующей роли ДНК явилось решающим аргументом в пользу того, что генетическая информация находится в ДНК, а не в белке, как предполагали.

Бактериальные клетки различаются по способности к трансформации. Это зависит от их генетических особенностей: от выделения ДНК-азы, образования капсулы, препятствующей проникновению ДНК; от состава среды, влияющей в свою очередь на физиологическое состояние клеток и др.

Процесс трансформации разделяют на ряд стадий: 1) контакт ДНК с реципиентной клеткой; 2) проникновение ДНК в клетку; 3) соединение трансформирующей ДНК с соответствующим фрагментом ДНК реципиента;

4) рекомбинация ДНК донора и реципиента; 5) репликация новой информации.

Путем трансформации передаются разные свойства: образование капсул, устойчивость к антибиотикам, способность к синтезу аминокислот, факторов роста и др.

Конъюгации (спаривание) – это передача генетического материала от

донорной к реципиентной клетке путем их непосредственного контакта. Контакт клеток является необходимым условием конъюгации, при котором сблизившиеся родительские клетки соединяются обычно с помощью конъюгационных мостиков (половые ворсинки – пили, через которые происходит обмен генетическим материалом).

Открытие конъюгации бактерий принадлежит Ледербергу и Татуму

(1946). Конъюгация – однонаправленный, или асимметричный процесс, т.е. перенос генетического материала происходит в одном направлении – от донорной (мужской) клетки к рецепиентной (женской). Следовательно, в конъюгацию могут вступать только клетки разного пола: мужские донор-ные клетки F+ и женские ренипиентные клетки F-.

Возможность клетки стать донором определяется наличием специифического полового фактора F(от лат. fertility – плодовитость). Половой фактор F, представляет собой фрагмент ДНК, обуславливает образование на поверхности клетки одной или двух так называемых фимбрий или pili, принимающих участие в конъюгации. Половой фактор F представляет собой фнехромосомный фактор наследственности – называемый эпи-сомами. Через половые фимбрии или pili хромосома передается от доноров к реципиентам. Обычно при конъюгации передается не вся хромосома, а только часть ее.

Трансдукция – это перенос генетического материала из одной клетки в другую фактериофагом. Трансдукция была открыта в 1952 г. Циндером и Леденрберном.

Фаг может переносить гены, ответственные за различные свойства клетки: устойчивость к антибиотикам, токсинообразование, прототрофность. При трансдукции, как и при трансформации, переносятся только небольшие фрагменты ДНК – не более 1/100 длины бактериальной хромосомы.

Трансдуцирующими свойствами обладают только некоторые умеренные фаги, а именно: фаги, которые несут в составе своего генома фрагмент бактериальной хромосомы. Эти фаги дефективны: они не содержат полный набор собственных генов. Часть их генов остается в хромосоме бактерии (вместо взятых генов хромосомы).

Различают три типа трансдукции: общую или неспецифическую, специфическую или абортивную.

Общая трансдукция осуществляется умеренными фагами, которые при лизогенизации бактерий включаются в любой участок хромосомы и переносят затем любой фрагмент хромосомы-донора в реципинтную клетку. Фаги, обеспечивающие общую трансдукцию, могут передавать гены, контролирующие питательные потребности, ферментативную активность, устойчивость к лекарственным препаратам, подвижность, серологические и вирулентные свойства, т.е. любые свойства донорной клетки.

Специфическая трансдукция осуществляется фагами, геном (ДНК) которых при лизогенизации соединяется только с определенным участком

хромосомы бактерии, т.е. фаг имеет определенную точку прикрепления на хромосоме. Поэтому при освобождении такой фаг захватывает только рядом расположенную строго определенную область хоромосомы бактерий и передает ее реципиентной клетке.

Абортивная трансдукция происходит так же, как и неспецифическая, но фрагмент хромосомы донора, привнесенный фагом в реципиентную клетку, не включается в хромосому и не реплицируется, а располагается в цитоплазме клетки. Этот фрагмент при делении клетки передается только одной дочерней клетке, и только эта клетка несет новое свойство, контролируемое привнесенным геном донорной клетки.

Трансдукцию необходимо отличить от фаговой конверсии. При трансдукции любого типа изменения происходят лишь в тех инфицированных фагом клетках, в которые была внесена ДНК бактерий-доноров, т.е. кото-рые были инфицированы трансдуцирующими фагами. Это весьма небольшое количество бактериальной популяции. Изменения, вызванные трансдуцирующими фагами, очень стойкие, передаются потомству и сохраняяются даже тогда, когда клетка теряет фаг.

Фаговая, или лизогенная конверсия – это изменения фенотипа (свойств клетки), обусловленные заражением клетки фагом. Изменения здесь вызывают гены фага. Они могут непосредственно контролировать синтез отдельного фермента или, взаимодействуя с бактериальными генами, приводить к изменению фенотипа клетки. Чаще всего фаговая конверсия затрагивает синтез или активность ферментов, контролирующих образование клеточных компонентов, что сопровождается изменениями морфологии колоний. Так, лизогенизация шероховатых штаммов микробактерий приводит к образованию гладких колоний. Изменение испытывают все инфицированные фагом клетки (при трансдукции – одиночные). При фаговой конверсии изменения фенотипа бактерий сохраняются до тех пор, пока в клетке присутствует фаг. Практическое примене-ние мутантов микроорганизмов.

Получение новых форм микроорганизмов с наследственно закрепленными полезными свойствами имеет большое значение для практичес-кой микробиологии. Такая возможность впервые была открыта Г.А. Надсоном. Он явился основоположником радиационной микробиологии. Еще в 1925совместно со своим учеником Г.С.Филипповым, воздействуя лучами Рентгена на низшие грибы, он получил новые расы, отличающиеся морфологическими признаками, стойко сохраняющимися в ряде поколений.

Однако широкое признание исследования Надсона получили лишь в 40х годах, когда в результате воздействия рентгеновскими и УФ-лучами на продуцент пенициллина – Pen.chysogenum были получены штаммы, обладающие в 2 раза большей продуктивностью по сравнению с исходным штаммом. Дальнейшее применение мутагенных факторов в сочетании с тщательным отбором позволило в 100 раз повысить продуктивность гриба. Если самые продуктивные из диких штаммов Pen.chysogenum в опти-

мальных условиях давали около 100 ед/мл пенициллина, то мутантные штаммы этого гриба, применяемые в последние годы в производстве антибиотика, образуют до 100000 ед/мл пенициллина.

Кроме повышения биосинтетической способности продуцента,

применение УФ-лучей дало возможность получить его беспигментный мутант. Это сыграло большую роль в пенициллиновой промышленности, так как существенно облегчило процесс химической очистки готового продукта.

Значительное увеличение продуктивности антибиологической про-

мышленности достигнуто при селекции других продуцентов антибиотиков, таких, как Act.strepomycini – продуцент стрептомицина, Act. strepomycini – продуцент хлортетрациклина и др.

В настоящее время почти все антибиотики вырабатываются путем

применения мутантных штаммов. Успехи мутационной селекции продуцентов антибиотиков легли в основу разработки новых методов селек-ции других полезных форм микроорганизмов: продуцентов аминокислот, витаминов, ферментов. Только в Японии в 1963 г. благодаря применению высокоактивных мутантных штаммов Micrococcusglutamicus микробиологическим методом было получено 48000 т кристаллической глутами-новой кислоты. Среди продуцентов аминокислот особое место занимает биохимический мутант продуцента лизина. Он синтезирует в 300-400 раз больше лизина, чем обычные естественные штаммы, в то время как самые лучшие из изученных природных штаммов в оптимальных условиях ферментации синтезируют не более 0,4-0,6 мг лизина на 1 мл среды.

Под действием УФ-лучей и радиоактивного кобальта были получены

ауксотрофные мутанты Bac.Subtilis и M.glutamicus, обладающие высокой способностью к биосинтезу данной аминокислоты (до 25 г/л). Широкое применение в производстве мутанта M.glutamicus (ауксотрофный по гомосурину) привело к значительному снижению себестоимости лизина, и его начали использовать в качестве добавки в растительные корма животных. Применение мутантов в производстве аминокислот микробиологическим методом вытесняет старые промышленные методы химического синтеза и выделения их из гидролизатов белков.

В последнее время индуцированные мутанты начинают занимать

ведущее место в микробиологической промышленности.

6.2 Генетическая инженерия.

Генетическая инженерия - ветвь молекулярной генетики, исследующая

возможности и способы создания лабораторным путем (invitro) генетических структур и наследственно измененных организмов, т.е. создания искусственных генетических программ, с помощью которых направленно конструируются молекулярные генетические системы вне организма с последующим их введением в живой организм. Обычно употребляют два названия данного научного направления - генетическая инженерия и генная инженерия, являющиеся как бы синонимами. Однако их смысловое содержание неодинаково: генетическую инженерию связы-вают с генетикой,

а генная имеет отношение только к генам. Кроме того, генетическая инженерия точнее раскрывает содержание дисциплины - создание генетических программ, основная задача которых - создание invitroмолекул ДНК посредством соединения фрагментов ДНК, которые в естественных условиях чаще не сочетаются благодаря межвидовым барьерам (рекомбинантные ДНК). Молекула рекомбинантной ДНК представляет собой соединенные в бесклеточной системе два компонента: вектор, обеспечивающий механизм репликации и экспрессии, и фрагмент клонируемой («чужеродной») ДНК, содержащий интересующие исследователя генетические элементы. Согласно определению национальных институтов здоровья США, «рекомбинантными ДНК» называют молекулы ДНК, полученные вне живой клетки путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами, способными реплицироваться в клетке». Генетическая инженерия возникла на стыке многих биологических дисциплин: молекулярной генетики, энзимологии, био-химии нуклеиновых кислот и др. Первая рекомбинантная ДНК получена в 1972 г. (П. Бергом с сотр.) и была составлена из фрагмента ДНК обезья-ньего вируса ОВ40 и бактериофага Xdvgalс галактозным опероном Е. coli. Формально 1972 г. следует считать датой рождения генетической ин-женерии.

Генетическая инженерия имеет яркую историю благодаря тому общественному резонансу, который она вызвала с самых первых своих шагов. Начало этим событиям положило послание участников Гордо-новской конференции (1973) президиуму АН США, в котором говорилось о возможной опасности технологий рекомбинантных ДНК для здоровья человека. Возможные блага генетической инженерии признавались с самого начала, но разногласия по данной проблеме не затихли и сейчас.

Единицы наследственности — гены, передаваемые отродительского поколения организмов дочерним особям и определяющие наследственные свойства организмов, осуществляют свою функцию путем конт-роля реакций биосинтеза ферментативных белков, при этом один ген конт-ролирует структуру одного ферментативного белка. Ген представляет собой отрезок ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты), несущий информацию, необходимую для синтеза одного белка. При делении клетки происходит удвоение молекул ДНК, и каждая дочерняя клетка получает по одной копии материнской ДНК с определенным набором функцио-нальных единиц — генов.

Отрезок ДНК, соответствующий одному гену, служит матрицей для синтеза так называемой мРИК. (информационной, или матричной, рибонуклеиновой кислоты). При этом генетическая информация, закодированная в структуре ДНК, как бы переписывается в структуре мРНК. Этот процесс получил наименование транскрипции. Молекула мРНК служит непосредственно в качестве матрицы для синтеза соответствующего ферментативного белка (процесс, называемый трансляцией).

Гены в клетках функционируют не все одновременно — часть генов находится в активном (функциональном) состоянии, а часть — в

репрессированном состоянии. В каждой дифференцированной клетке в активном состоянии находятся только те гены, которые определяют ее специфическую структуру и функцию. В разных типах клеток в активном состоянии находятся разные участки генома (разные гены), причем эти участки генома по своей относительной величине невелики — в каждый момент времени большая часть генов в клетке находится в репрессированном состоянии. В. клетках имеется специальный механизм регуляции функции генов, в котором определенные участки генома представлены регуляторными генами. В регуляторной части генома закодирована программа индивидуального разви- тия организма. Отсюда следует: для того чтобы придать организму новое наследственное свойство, необходимо ввести в него соответствующий ген (группу генов) и добиться его функционирования в соответствующих клетках, его под-ключения к их регуляторной системе.

Решение такой задачи средствами генетической инженерии

подразделяется на три этапа; 1) получение генетического материала (генов); 2) введение генетического материала в изменяемый

организм; 3) включение внесенных генов в генетический аппарат клетки,

закрепление их в ней. Рассмотрим эти этапы в отдельности.

1. Получение генетического материала. Желательный ге-

нетический материал (ген или группа генов) может быть получен путем его выделения из генома клеток, используемых в качестве доноров, или же, путем синтеза. Синтез соответствующих образцов ДН'К может быть осуществлен химическим путем или с помощью матричной РНК и специального фермента, называемого обратной транскриптазой, или ре-

вертазой.

Примером химического синтеза гена являются поразившие весь научный мир работы группы X. Кораны (США), которая, проделав тита-нический труд, впервые химическим путем синтезировала индии-видуальный ген, а именно ген аланиновый транспортной РНК пекарских дрожжей (1970).

Примером выделения гена являются опыты И. Беквита по изолированию генов [5-галактозидазы (1969) у кишечной палочки. Названный ген контролирует способность организма усваивать молочный сахар, содержащий галактозу.

2. Введение (перенос) генетического материала. Для введения в

клетку генетического материала (генов) используются три пути: трансформация, т. е. перенос генетической информации посредством препаратов ДНК, свободных от примесей, с последующим замещением фрагментами экзогенной ДНК гомологичных участков генома в клеткереципиенте;

трансдукция, т.е.перенос генетического материала (генов) посредством вирусов;

гибридизация соматических клеток и кноъюгации у микроорганиз- мов (и простейших).

Открытие явления трансформации у микроорганизмов, как

известно, имело решающее значение для доказательства положения о том, что ДНК играет роль носителя наследственности и что ген представляет собой участок ДНК, несущий информацию для синтеза одного ферментативного белка. В генетическом отношении трансформация представляет собой особый способ осуществления рекомбинации генов неполовым путем, за счет переноса и включения фрагментов ДНК из клеток доноров в геном клетки-реципиента. При этом гомологичные участки эндогенной ДНК исключаются из генов, а фрагменты экзогенной ДНК, включившиеся в геномреципиента, передаются всем потомкам трансформированной клетки.

Трансдукция как способ переноса генетического материала является

естественным и распространенным среди микроорганизмов процессом получения генетических рекомбинаций, который отличается от трансформации только тем, что ДНК в первом случае переносится с помощью вируса ( фага) .Явление трансдукции широко используют в генетической инженерии микробов, для которых такой способ переноса генов выработан самой природой.

Конъюгации (спаривание) – это передача генетического материала от

3. Включение новых генов в генетический аппарат клетки. Третья

группа проблем генетической инженерии связана с изучением возможностей функционирования гена в чужеродной среде. Дело не только в том, чтобы ввести в клетку определенный фрагмент ДНК. Необходимо, чтобы этот фрагмент был включен в функционирующую ДНК, т. е, химически встроился в молекулу ДНК клетки. Он должен также органически слиться с генетической системой клетки, сохраняя при этом свою биохимическую активность. Это значит, что введение гена должно быть осуществлено таким образом, чтобы подчинить его тем регуляторным механизмам, которые присущи генетической системе клетки. В противном случае ген работать не может. При введении гена у микроорганизмов используются фаги и специальные клеточные структуры-плазмиды.

4. Технология рекомбинантных ДНК включает набор как новых

методов, так и заимствованных из других дисциплин, в частности из генетики микроорганизмов. Эти методы существенно расширяют возможности генетических исследований. Используя технологию рекомбинан-тных ДНК, получают даже минорные клеточные белки в больших количествах и проводят тонкие биохимические исследования структуры и функ-ций белков, а также осуществляют детальный химический анализ генетического материала. К наиболее важным методам биотехнологии рекомби-нантных

ДНК следует отнести следующие:

1. Специфическое расщепление ДНК рестрикцирующими

нуклеазами, что в значительной степени ускоряет выделение различных

генов и манипуляции с ними.

2. Быстрое секвенирование всех нуклеотидов в очищенном

фрагменте ДНК, позволяющее определить точные границы гена и

кодируемую им аминокислотную последовательность полипептида.

3. Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая с большой

точностью выявить специфические нуклеотидные последовательности на

основе их способности связывать комплементарные основания.

4. Клонирование ДНК, суть которого сводится к введению ДНК-

фрагмента в самореплицирующийся генетический аппарат (плазмиду или вирус), который используют для трансформации бактерий. Бактериальная клетка после трансформации способна воспроизводить этот фрагмент во

многих миллионах идентичных копий.

5. Генетическая инженерия, позволяющая получать

модифицированные версии генов и затем внедрять их в клетки или

организмы.

Технология рекомбинантных ДНК оказала существенное воздействие на всю клеточную биологию, позволяя решать такие задачи, как определение строения и функций не только белков, но и индивидуальных доменов, а также расшифровывать механизмы регуляции экспрессии ге-нов, получать многие белки, участвующие в регуляции обменных про-цессов, клеточной пролиферации и развитии организма.

Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей осуществляется особыми ферментами – рестрикцирую-щими нуклеазами, способными разрушить чужеродную ДНК. Все ферменты условно можно разделить на следующие группы:

1) используемые для получения фрагментов ДНК;

2) синтезирующие фрагменты ДНК на матрице РНК;

3) соединяющие фрагменты ДНК;

4) позволяющие осуществить изменение структуры концов

фрагментов ДНК;

5) применяемые для приготовления гибридизационных проб.

Каждый фермент, способный разрушить чужеродную ДНК, опознает в

ней специфическую последовательность из 4-6 нуклеотидов.

Соответствующие последовательности в геноме бактерий замаскированы метилированием остатков с помощью метилаз.

Согласно номенклатуре, предложенной X. Смитом и Д. Натансоном, название рестриктазы складывается из трех букв: первая обозначает родовое название, две последующие — первые буквы вида. Например, фермент из Е. coliобозначают как Есо или из Haemophilusinfluenzae— Hinи т.д. Типовая или штаммовая идентификация следует за родовидовой, например, EcoRIили Hindllи т.д. В настоящее время различные фирмы выпускают более 100

разнообразных ферментов, опознающих различные последовательности нуклеотидов. Для каждого конкретного фермента они различаются по длине, первичной структуре и способу разрыва молекулы ДНК. Подавляющее большинство ферментов разрывает только двунитевую ДНК с образованием серии фрагментов, называемых реестрикционными (или рестриктами; с тупыми концами.

Многие рестриктазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на

(Hindlll) несколько нуклеотидов и образованием на концах фрагментов коротких одноцепочечных участков. Они способны образовывать комплементарные пары оснований с любым другим одноцепочечным участком, полученным с помощью того же фермента (липкие концы). Липкие концы позволяют легко соединить два любых фрагмента ДНК в одно целое. Полученный фрагмент ДНК (любого происхождения) можно встроить в очищенную ДНК плазмиды или бактериального вируса.

Сравнение размеров фрагментов ДНК после обработки соответствующего участка генома набором рестриктаз позволяет построить рестрикционную карту, отражающую расположение определенной последовательности нуклеотидов в данном участке. Сравнением таких карт можно оценить степень гомологии между отдельными генами (участками) без определения их нуклеотидной последовательности. Рестрикционные карты важны для клонирования ДНК, решения эволюционных и филогенетических задач.

Для успешного решения задач генетической инженерии очень важно быстро секвенировать (определить последовательность нуклеотидов) любые очищенные фрагменты ДНК. В настоящее время объем информации о последовательностях ДНК столь велик, что для хранения и анализа данных о фрагментах, целых геномах необходимы новые технологии и компьютерная техника. НК-В биотехнологии рекомбинантных ДНК обычно используют два

различных метода секвенирования ДНК: химический и ферментативный.

Оба метода чрезвычайно надежны, быстры в исполнении и результативны. Результаты секвенирования позволяют также на основе генетического кода определить аминокислотную последователь-ность белка в соответствии с нуклеотидной последовательностью в со-ответствующем гене.

Генетическая инженерия сулит новые, порой граничащие с фантастикой возможности нашего вмешательства в наследственность, открывает перспективы более эффективного решения некоторых практических вопросов медицины и сельского хозяйства. В частности, станет возможным получение рекомбинантных генотипов для целей селекции не путем скрещивания растений и животных, а с помощью хирур-гических приемов — пересадки генов или слияния протопластов у растений. С развитием этих методов могут быть, значительно ускорены начальные этапы селекции, устранены многие нежелательные побочные явления, свойственные простому скрещиванию организмов.

Разработка методов получения генетических копий (клонов) сельско-

хозяйственных животных, в том числе крупного рогатого скота, путем пересадки ядер соматических клеток в яйцеклетки, лишенные ядер, может, по всей видимости, привести к существенному улучшению методов племенной работы.

В принципе возможен перенос генов из микроорганизмов в растения для

придания последним новых ценных свойств, например, способности фиксировать атмосферный азот. Еще более актуальны задачи переноса генов высших растений в микроорганизмы для создания принципиально новых продуцентов, способных обеспечить медицину, сельское хозяйство, пищевую и легкую промышленность продуктами, в настоящее время получаемыми только в сельскохозяйственном производстве.

В будущем возможны значительные успехи в области борьбы с наследственными заболеваниями у человека путем введения недостающего или замены неполноценного гена. Развитие исследований по генетической инженерии обещает открыть принципиально новые методы борьбы с раком – методы генетического контроля злокачественных наследственных изменений в соматических клетках, а также вооружить человека новыми средствами в борьбе за долголетие.

Вопросы для самопроверки

1. Понятие о наследственности

2. Понятие о изменчивости

3. Понятие о мутации

4. Типы мутации

5. Рекомбинация

6. Трансформация

7. Коньюгация

8. Трансдукция

9. Генетическая инженерия

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 5 6 7 89 / 179 10 11 12 13 14 15 16 17 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]