Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Основы промышленной биотехнологии. Учебное пособие
.pdf
растительными маслами.
Из-за образования в клетках микроорганизмов активных комплексен
гидролитических ферментов они способны утилизировать в качестве
источников углерода различные субстраты — гидролизаты растительных
отходов, послеспиртовую барду, молочную сыворотку, мелассу, отходы
зерноперерабатывающей промышленности, углеводороды нефти, низкомолекулярные спирты (метанол, этанол).
Наряду с получением кормовых липидов на основе ферментации
микроорганизмов разрабатываются также технологии производства комплексных микробных препаратов, содержащих белки, липиды, каротипоиды
и другие ценные питательные вещества, которые позволяют балансировать
корма одновременно по нескольким компонентам. Следует отметить, что
липиды микроорганизмов могут быть использованы не только в
кормопроизводстве, но и как заменитель растительных пищевых жиров,
используемых на технические нужды (лакокрасочная, химическая промышленность), так как примерно 20% от производимых в мире растинллъных жиров расходуется на технические, непищевые цели.
8.4 Фементные препараты.
Одним из важных направлений современной биотехнологии является
получение на основе культивирования микроорганизмов и использование в
сельском хозяйстве различных ферментных препаратов, которые могут
применяться в процессе приготовления кормов для сельскохозяйственных
животных как добавки к кормам в целях улучшения их усвояемости, а также
в ветеринарии для профилактики и лечения желудочных и паразитарных
заболеваний.
Основной компонент кормов сельскохозяйственных животных растительная продукция (зерно, силос, грубые корма и др.), содержащая
довольно много трудноперевариваемых веществ, — клетчатка, лигнин,
гемицеллюлоза. Даже у жвачных животных, содержащих в преджелудке
(рубце) активные штаммы целлюлозоразлагающих микроорганизмов, клетчатка переваривается на 40—65%. Не полностью перевариваются также
растительные белки (60—80%), липиды (60—70%), крахмал и полифруктозиды (70—85%), пектиновые вещества.
В целях улучшения перевариваемости и повышения эффективности
использования растительных кормов в рационы сельскохозяйственных
животных вводят ферментные препараты (0,1—1,5% от сухой массы корма),
полученные из микроорганизмов и содержащие активные ком-плексы
гидролитических ферментов. Препараты микробных ферментов получают из
культур бактерий или микроскопических грибов. Некоторые виды бактерий
(например, Вас. Subtilis) выделяют идролитические ферменты в
культуральную среду, поэтому их ферментные препараты производят путем
концентрирования и высушивания при определенных условиях
(лиофилизацией) культуральной жидкости. Если источником ферментов
являются микроскопические грибы (Aspergillus, Mchoderma, Fusarium), то
121
ферментный препарат готовят высушиванием тншрхностной культуры этих
микроорганизмов. Очищенные ферментные препараты по-лучают
экстракцией ферментов из клеток микроорганизмов подходящим
растворителем и осаждением фермента этанолом.
Каждый ферментный препарат обозначается определенным буквенным
и цифровым индексом. Буква «Г» в названии препарата указывает, что он
получен из культуральной жидкости при глубинном способе выращивания
микроорганизмов, тогда как буква «П» свидетельс-твует о том, что
ферментный препарат получен из поверхностной культу-ры
микроскопических грибов.
Особенно важное значение имеет применение ферментных препа-ратов
при кормлении молодняка сельскохозяйственных животных. Фер-ментные
препараты используются в кормопроизводстве, чаще всего при силосовании
бобовых трав, соломы, картофеля и приготовлении соломоконцентратов; в
процессе получения заменителей цельного молока для молодняка крупного
рогатого скота из кормовых дрожжей, которые подвергаются гидролизу;в
ветеринарии для лечения и диагностики многих заболеваний
сельскохозяйственных животных и птиц.
Наряду с производством ферментных препаратов, выделяемых из микробных клеток, разработаны технологии получения биопрепаратов на основе живых микроорганизмов — симбионтов желудочнокишечного тракта
животных, которые в процессе своей жизнедеятельности синтезируют
различные ферменты, витамины, незаменимые аминокислоты, антибиотики,
вещества, обладающие гормональным действием, и. таким образом активно
участвуют в процессах пищеварения и синтеза веществ, не образующихся в
клетках животных, защите от микробной инфекции.
Эффективные микробные препараты, широко использующиеся в животноводстве, производятся на основе пропионовокислых (пропиовит) и
ацидофильных (пропиацид) бактерий, а также азотобактерий (азотацид).
Пропиовит представляет собой порошок серовато-песчаного цвета,
содержащий в 1 г препарата 4—6 млрд. бактерий и 80—100 мкг витамина
В]2, применяется для профилактики и лечения болезней желудочно-кишечного тракта у телят, поросят, цыплят. При его применении нормализуется
рост и развитие молодняка сельскохозяйственных животных, повышается их
устойчивость к инфекционным заболеваниям.
Иропиацид и азотацид — сухие препараты комбинированного действия способствуют образованию в желудочно-кишечном тракте животных
уравновешенных биоценозов, особенно они эффективны против дисбактериозов.
Для борьбы с бактериальными и вирусными желудочно-кишечными
иИолеваниями применяются бактериальные препараты на основе Вас.
Mihtilis, licheniformis, mucilaginosis, которые, вероятно, действуют как
источники биологически активных веществ — ферментов, витаминов,
антибиотиков, гормонов.
122
Важной задачей ученых и специалистов, работающих в области
сельскохозяйственной биотехнологии, является создание и внедрение в
природные экосистемы желудочно-кишечного тракта животных высокоактивных штаммов микроорганизмов, способных к лучшему перевариванию
целлюлозы и других углеводов, растительных белков и липидов, сверхситезу
незаменимых аминокислот и витаминов. Важное значение имеют
исследования по изучению микробных популяций рубца (преджелудка)
жвачных животных, в котором подвергается перевариванию 70-
85% всего сухого вещества корма, проходящего через желудочно кишеч-
ный тракт этих животных.
Создание высокоактивных штаммов микроорганизмов проводится
методами генетики и селекции, с использованием мутагенеза и клонирования генов. Применение этих методов позволит целенаправленно изменять экосистемы желудочно-кишечного тракта ли нотных в нужном направлении, добиваясь улучшения усвояемости корма,усиления синтеза
полезных веществ, подавления патогенной микрофлоры.
Вопросы для самопроверки
1. Получение пищевого белка
2. Получение кормовых белков
3. Белковые концентраты из бактерий
4. Кормовые белки из водорослей
5. Белки грибов
6. Получение незаменимых аминокислот
7. Синтез лизина
8. Кормовые витамины
9. Кормрвые липиды
10. Ферментные препараты
123
ГЛАВА 9. БИОИНЖЕНЕРИЯ В
АГРОИНДУСТРИИ
9.1 Биотехнология в животноводстве. Разработка метода
искусственногоосеменения сельскохозяйственных животных и его
практическое применение обеспечили бльшой успех в области улучшения
генетики животных. Использование этого метода в сочетании с длительным
хранением семени в замороженном состоянии открыло возможность
получения десятков тысяч потомков от одногопроизводителя в год. Этот
прием, по существу, решает проблему рационального использования производителей в практике животноводства. Что касается самок, то традиционные
методы разведения животных позволяют получать от них лишь несколько
потомков за всю жизнь. Низкий уровень воспроизводства у самок и длительный
интервал времени между поколениями (6—7 лет у крупного ро-гатого скота)
ограничивают генетический процесс в животноводстве. Решение этой проблемы
ученые видят в применении метода трансплантации эмбрионов.
9.1.1 Трансплантация эмбрионов. Суть метода состоит в том, что
генетически выдающиеся самки освобождаются от необходимости вынашивания плода и вскармливания потомства. Кроме того, гамулируют с целью
увеличения выхода яйцеклеток, которые затем извлекают на стадии ранних
зародышей и пересаживают менее ценным в генетическом отношении
реципиентам.
Технология трансплантации эмбрионов включает такие основные звенья,
и как вызывание суперовуляции, искусственное осеменение донора, извлечение
эмбрионов (хирургическое или нехирургическое), оценка их качества,
кратковременное или длительное хранение и пересадка.
Стимуляции суперовуляции. Самки млекопитающих рождаются с
большим (несколько десятков и даже сотен тысяч) числом половых клеток.
Большинство из них постепенно погибают в результате атрезии фолликулов.
Только небольшое число примордиальных фолликулов переходят в ант-ральные
в процессе роста. Однако практически все растущие фолликулы реагируют на
гонадотропную стимуляцию, которая приводит их к конечному созреванию.
Обработка самок гонадотропинами в фолликулярной фазе полового цикла или в
лютеиновой фазе цикла в сочетании с индуцированием рег-рессии желтого тела
простагландином Ф2 (ПГФ2) или его аналогами при-водит к множественной
овуляции или так называемой суперовуляции.
Крупный рогатый скот. Индукцию суперовуляции у самок крупного
рогатого скота проводят обработкой гонадотропинами, фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ) или сывороткой крови жеребой кобылы (СЖК),
начиная с 9—14-го дня полового цикла. Через 2—3 дня после начала обработки
животным вводят простагландин Ф
рессию желтого тела. Проведены многочисленные испытания разных схем
или его аналоги, чтобы вызвать рег-
2 а
124
гормональной обработи коров и телок с целью индукции полиовуляции.
Наиболее широко в этих целях используют СЖК в дозе 2,5—3,0 тыс. и.е.
Известно, что период полужизни эндогенного СЖК у кобыл,
установленный гистеректомией, составляет около 6 дней, а при использовании
радио-иммунологического метода выявлено наличие двух комплексов в СЖК —
один с периодом полужизни 40,0—51,2 ч, второй—118,4—129,4 ч.
Это свойство СЖК позволяет ограничиться однократным введением его
животным при вызывании суперовуляции и вместе с тем может иметь отрицательный эффект вследствие длительного действия на функцию яичников не
только в период, предшествующий охоте, но и после нее. Это приводит к
нарушению нормального уровня половых гормонов и особенно их
соотношения в организме животных.
Для устранения этого нежелательного свойства СЖК в последнее
время применяют антитела к гонадотропину с целью увеличения числа и
улучшения качества эмбрионов, полученных при суперовуляции.
Введение во время охоты коровам, обработанным 3000 и.е. СЖК н
10-й день цикла и 37,5 мг ПГФ2 на 12-й день, моноклональных антител
или овечьей антисыворотки к СЖК уменьшило число неовулировавших
фолликулов (1,7 и 2,7 против 6,5 фолликула в контроле) и повысило оплодотворяемость (>80 % против 60 % в контроле). Уровень эстрогенов в
крови коров резко понижался вскоре после введения антисыворотки и оставался низким до извлечения эмбрионов, тогда как у контрольных
животных уровень эстрогенов не снижался до базального уровня во
врамя охоты и снова увеличивался после охоты (Дж. Мауэрт и др., 1985).
Для стимуляции полиовуляции у коров наряду с СЖК применяют
гипофизарные гонадотропины. С этой целью используют очищенный
ФСГотдельно или в сочетании с ЛГ. В отличие от СЖК препараты ФСГ и
ЛГ вводят дважды в день в течение 4—5 сут.
При этом охота наступает через 40—50 ч после первой инъекци
ПГФ2а. Осеменение проводят через 12 и 24 ч после наступления охоти
Эмбрионы извлекают нехирургическим способом через 7—7,5 дня после
осеменения.
В связи с тем, что сроки овуляции у гормонально обработанных животных увеличиваются, изменяется и технология их осеменения. Первоначально рекомендовалось многократное осеменение коров с использованием нескольких доз спермы. Обычно вводят 50 млн. живых
сперматозоидов в начале охоты и через 12—20 ч осеменение повторяют.
Более детальное изучение этого вопроса показало, что высокая
эффективность оплодотворения может быть достигнута и при использовании одной дозы семени, если ее вводить через 24 ч после начала
охоты.
Овцы.Принципы вызывания суперовуляции у овец те же, что и у
крупного рогатого скота: СЖК или ФСГ вводят в конце лютеиновой фазы
полового цикла (на 11—13-й день) или в лютеиновую фазу цикла — вместе с
125
обработкой простагландином или во время окончания обработки
прогестагенами. СЖК вводят в дозе 20—45 и.е. на кг массы тела, или до Ю00
и.е. на одну овцу. Например, аналог простагландина простенол в ряе 100 мкг
вводят между 4-м и 13-м днями полового цикла через .—72 ч после
обработки СЖК. Охота наступает через 2—4 дня после обработки простагландином. ФСГ предпочтительнее вводить два раза в день в течение двух
дней в уменьшающейся дозе (6,5—3,2 мг) по сравнению с обработкой равными
дозами.
Свиньи. У свиней, являющихся многоплодными животными, боль-шое
число эмбрионов может быть получено без гормональной обработки. Однако
число овуляций у свиней может быть увеличено после гормональной обработки.
Лошади. Еще не разработаны надежные методы индукции супероруляции у кобыл, однако получение достаточного числа эмбрионов у них
составляет большого труда ввиду простоты нехирургического извлечения и
повторного получения эмбрионов в каждый половой цикл.
Извлечение эмбрионов. Эмбрионы крупного рогатого скота поступают
из яйцевода в матку между 4-м и 5-м днем после начала охоты (между 3-м и 4-м
днем после овуляции), хотя у суперовулировавших коров небольшая часть
эмбрионов остается в яйцеводе до 7-го дня. Сроками продвижения эмбрионов в
половом тракте коровы и определяется извлечение их из яйцевода или рогов
матки.
В связи с тем, что нехирургическое извлечение возможно только из
рогов матки, то эмбрионы извлекают не ранее 5-го дня после начала охоты.
Несмотря на то что при хирургическом извлечении эмбрионов у крупного рогатого скота достигнуты отличные результаты, этот метод неэффективен — относительно дорогостоящий, неудобный для применения в усло-виях
производства.
Нехирургическое извлечение эмбрионов состоит в следующем. Гибкий
катетер с надувной манжеткой вводят во влагалище и через матки в один из
рогов матки. Манжетка надувается и закрывает каудальный выход рога матки,
тем самым ограничивая промывную полость. Катетер может быть
двухканальным, что позволяет проводить проточное прохождение промывной
жидкости. При использовании одноканального катетера промывная жидкость
вводится несколько раз (5—8 и затем вытекает из рога матки. В обоих случаях
вводят 200—300 мл фосфатного буфера Дюльбекко.
Наиболее оптимальные сроки для извлечения эмбрионов — 6—8-й
после начала охоты, так как ранние бластоцисты этого возраста наиболее
пригодны для глубокого замораживания и могут быть с высокой активностью
пересажены нехирургическим способом. Корову-донора используют 6—8 раз в
год, извлекая по 3—6 эмбрионов.
У овец и свиней нехирургическое извлечение эмбрионов невозможно ввиду
трудности прохождения катетера через шейку в рога матки. Однако
хирургическая операция у этих видов животных относительно проста и
непродолжительна. Доступ к репродуктивному тракту осуществляется лапа-
126
ротомией по белой линии живота. У свиней 1-, 2- и 4-клеточные эмбрионы
извлекают из яйцеводов в течение 40 ч после овуляции. При этом стеклянную
канюлю вставляют в истмус через маленькое отверстие в верхушке рога матки.
Через канюлю вводят 20—30 мл промывной жидкости и собирают ее из
ампулярного конца яйцевода в чашку Петри. Для извлечения эмбрионов из
матки промывают яйцевод и верхушку рога матки. Рог матки пережимают и
канюлю вставляют в рог матки. Обычно для вымывания используют среду
Дюльбекко с лактатом, пируватом и бычьим сывороточным альбумином.
Эмбрионы свиней можно извлекать до 12-го дня после начала охоты.
Эффективность извлечения эмбрионов обычно высокая (около 95%). Можно
делать 3—4 операции на одном животном (С. Полдж, 1982).
При извлечении эмбрионов у овец в ампулярный конец яйцевода вводят
стеклянную или полиэтиленовую канюлю и промывают из рога матки в яйцевод.
Независимо от времени вымывания поле охоты эффективность извлечения
эмбрионов составляет около 80%.
Пересадка эмбрионов. Параллельно с разработкой хирургического
метода извлечения эмбрионов у крупного рогатого скота значительный
прогресс был достигнут и в нехирургической пересадке эмбрионов. В пайету
набирают свежую питательную среду (столбик длиной 1,3 см), затем
небольшой пузырек воздуха (0,5 см) и далее основной обьем среды с эмбрионом
(2—3 см). После этого засасывают немного воздуха (0,5 см) и питательную
среду (1,0—1,5 см). Пайету с эмбрионом мещают в катетер Кассу и до момента
пересадки хранят в термостате рн 37°С. Далее под ректальным контролем
катетер пропускают через шейку матки и осторожно вводят в рог матки на
расстоянии 5—7 см от ее тела. Нажатием на шток катетера выдавливают
содержимое пайеты вместе с эмбрионом в рог матки.
Эффективность пересадки эмбрионов в значительной степени
определяется синхронностью проявления охоты у донора и реципиента. У
крупного рогатого скота максимальное число беременностей получают после
синхронной пересадки.
Введение эмбрионов в оба рога матки обеспечивает высокую эффективность пересадки. Этот прием успешно используют для получения
двойневости. Процедура получения двойневости включает пересадку 7 дневных эмбрионов осемененному животному в рог, противоположный
яичнику с желтым телом.
Нехирургическая пересадка эмбрионов разработана также для кобыл.
Высокая эффективность нехирургической пересадки эмбрионов у лошадей была
достигнута между 6-м и 8-м днями после овуляции.
У овец и свиней пересадку эмбрионов проводят только хирургическим
способом. У реципиентов используется аналогичный хирургический подход,
как и у доноров. Эмбрионы пересаживают в яйцевод или матку в зависимости
от стадии развития.
127
Эмбрионы овцы, извлеченные на 1—4-й день после охоты, пересаживают в
яйцевод, а эмбрионы более старшего возраста — в матку. Приживляемость
составляет 70—75%.
У свиней приживляемость эмбрионов не снижается, если двухклеточные
эмбрионы извлекают из яйцевода и пересаживают в матку реципиента на той же
стадии развития. Эмбрионы свиньи рекомендуется пересаживать только в один
рог матки, так как они мигрируют и распределяются в обоих рогах матки. После
пересадки 2—5-дневных эмбрионов приживляемость составляет 60—70%.
Пересадка эмбрионов свиней на более поздних стадиях развития (7—8-дневных)
сопровождается либо отсутствием беременности, либо значительным
снижением приживляемостн (С. Полдж, 1982).
Хранение эмбрионов. Применение метода трансплантации эмбрионов
потребовало разработки эффективных методов их хранения в период между
извлечением и пересадкой. В производственных условиях эмбрионы обычно
извлекают утром, а пересаживают в конце дня. Для хранения эмбрионов в
течение этого времени используют фосфатный буфер с некоторыми
модификациями при добавлении эмбриональной сыворотке крупного рогатого
скота и при комнатной температуре или температуре 37°С.
Наблюдения показывают, что эмбрионы крупного рогатого скота можно
культивировать invitro до 24 ч без заметного снижения их последующей
приживляемости.
Пересадка эмбрионов свиней, культивируемых 24 ч, сопровождается
нормальной приживляемостью.
Выживаемость эмбрионов в определенной степени может быть увеличена
охлаждением их ниже температуры тела. Чувствительность эмбрионов к
охлаждению зависит от вида животного.
Эмбрионы свиней особенно чувствительны к охлаждению. Пока не удалось
сохранить жизнеспособность эмбрионов свиней на ранних стадиях развития
после охлаждения их ниже 10—15°С (С. Полдж, 1982).
Эмбрионы крупного рогатого скота на ранних стадиях развития также очень
чувствительны к охлаждению до 0°С. Однако на более поздних стадиях
развития, таких как морула или бластоциста, они хорошо выдерживают
охлаждение.
Эмбрионы овец хорошо переносят охлаждение до 0°С на любых стадиях
развития, от одно-, двухклеточной стадии до бластоцисты, Понижение
температуры хранения эмбрионов от 37°С до 10° и 0°С угнетает или останавливает их развитие, но обменные процессы протекают на уровне, обеспечивающем хранение до 5—6 сут. Для длительного хранения эмбрионов
необходимо не только затормозить их развитие, но и значительно снизить или
полностью остановить обменные процессы. Такое состояние эмбрионов
досттигается при температуре — 195°С или ниже. Эксперименты последних
лет позволили определить оптимальные соотношения между скоростью
охлаждения и оттаивания эмбрионов крупного рогатого скота. Установлено,
что если эмбрионы охлаждают медленно (1°С/мин) до очень низкой
128
температуры (ниже— 50°С) с последующим переносом в жидкий азот, то они
требуют и медленного оттаивания (25°С/мин или медленнее). Быстрое
оттаивание таких эмбрионов может вызвать осмотическую регидратацию и
разрушение. Если эмбрионы замораживают медленно (1°С/мин) только до - 25 и
40°С с последующим креносом в жидкий азот, то их можно оттаивать
очень быстро (300°С/мин). В этом случае остаточная вода при переносе в
жидкий азот трансформируется в стекловидное состояние (С. Вилладсен,
1980).
Выявление этих факторов привело к упрощению процедуры
замораживания и оттаивания эмбрионов крупного рогатого скота. В частности,
оттаивают эмбрионы, как и сперму, в теплой воде при 35°С в течение 20 с
непосредственно перед пересадкой без применения специального оборудования
с заданной скоростью повышения температуры.
В последние годы установлено, что замороженные и оттаявшие
эмбрионы могут быть успешно разбавлены одноступенчато в пайете, где они
были заморожены. Сущность метода состоит в следующем. Замороженооттаянные эмбрионы переносят одноступенчато из раствора крио-протектора, в
частности 1,5 М глицерина в фосфатном буфере, в котором они были
заморожены, в среду, содержащую гипертонический раствор не проникающего в
клетку соединения, каким является сахароза. Это обеспечивает постепенное
удаление криопротектора из эмбриона без нарушения осмотического
равновесия в 0,02 мл 1,5 М глицерина.
С помощью воздушных пузырьков пайету делят на три камеры: в первой -
раствор криопротектора; во второй — эмбрион в растворе криопротектора; в
третьей — растворитель (1,08 М раствор сахарозы). После замараживания и
оттаивания содержимое пайеты перемешивают встряхиванием. Затем эмбрион
может быть пересажен из пайеты нехирургическим способом реципиенту. Этот
метод позволяет пересаживать замороженно-оттаянные эмбрионы по типу
искусственного осеменения. Сравнение методов одноступенчатого и
многоступенчатого оттаивания эмбрионов показало, что оба они дают
одинаковые результаты.
Успешное замораживание и оттаивание эмбрионов овец впервые
проведено С. Вилладсен и др. (1974). Эмбрионы медленно охлаждали (от 0, 3 до
2,0°С/мин) и медленно оттаивали (от 4 до 25°С/ мин). В каче-криопротектора
применяли ДМСО. Позднее установлено, что при использовании 1,5 М ДМСО
в фосфатном буфере замораживание со скоростью 1°С/мин до - 120°С
сопровождалось выживаемостью эмбрионов только в том случае, если
применялось быстрое оттаивание (360°С/мин). Однако при замораживании со
скоростью 0,3°С/мин была сохранена выживаемость эмбрионов как при
быстром, так и при медленном оттаиваг нии (10 или 4°С/мин). При дальнейшем
уменьшении скорости замораживания до 0,1°С/мин в интервале температур
между - 30 и -60°С медленное оттаивание было обязательным.
Первый жеребенок был получен после пересадки 11 замороженно-
оттаянных эмбрионов, извлеченных на 6-й день после овуляции. Сообщалось о
129
получении двух жеребят после хирургической пересадки четырех
шестидневных замороженных эмбрионов трем реципиентам.
Таким образом, установлено, что эмбрионы крупного рогатого скота в
первые дни развития особенно чувствительны к охлаждению, но когда они
достигают стадии бластоцисты, то устойчивы к охлаждению в более широком
диапазоне стадий развития. У свиней ни на одной стадии развития эмбрионы не
выживают после охлаждения их до температуры ниже 10—15°С. Достигнуто
успешное замораживание до - 196°С и оттаивание эмбрионов крупного рогатого
скота, овец и лошадей на стадиях морулы и бластоцисты с получением живого
потомства у всех трех видов животных. На практике этот прием используют
пока при разведении крупного рогатого скота.
9.1.2Получение трансгенных животных. Применение методов
генетической инженерии живртноводстве открывает перспективу
изменения ряда свойств организма: повышение продуктивности,
резистентности к заболеваниям, увеличение скорости роста, улучшение
качества продукции и др. Животных, несущих в своем геноме
рекомбинантный (чужеродный) ген, принято называть трансгенными,а ген,
интегрированный в геном реципиента, — трансгеном. Продукт этого гена
(белок) является трансгенным. Благодаря переносу генов у трансгенных
животных возникают новые качества, а дальнейшая селекция позволяет
закрепить их в потомстве и создавать трансгенные линии.
Получение трансгенных животных предусматривает ряд этапов:
приготовление раствора ДНК для микроинъекции; извлечение эмбри-онов
из донорных организмов; микроинъекция ДНК и пересадка инъецированных эмбрионов в яйцеводы или после культивирования в матку
синхронизированных реципиентов. У родившихся потомков исследуют
экспрессию трансгена на уровне транскрипции и трансляции. Трансгенное
потомство получают путем использования традиционных методов
разведения животных. Следует отметить, что от приготовления инъекционного раствора ДНК (его чистоты, концентрации) во многом зависит эффективность получения трансгенных животных. Обычно гены транспортируют на
ранних стадиях развития животного (в большинстве случаев на стадии зиготы и
двухклеточных эмбрионов). Для трансформации генов в геном животного
используют следующие приемы:
микроинъекцию ДНК в пронуклеус зигот или в каждый бластомер у
двухклеточного эмбриона;
введение ДНК с помощью ретровирусных векторов;
получение трансгенных химер из генетически трансформированных клеток и
эмбрионов.
В настоящее время наиболее распространенный метод — микроинъекция
ДНК. Ее осуществляют с помощью специальной пипетки (внутренний диаметр
ее около 1 мкм), а количество инъецированного раствора ДНК составляет 1 — 2
пкл. После инъекции ДНК эмбрионы культивируют до момента пересадки
реципиентам. После небольшого культивирования invitro проинъе-цированные
130
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]