Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Основы промышленной биотехнологии. Учебное пособие

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

07.09.2026

Размер:

2 Мб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 12 / 172 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 > Следующая >>>

внешней стороне и транспортируют их к внутренней, откуда они высвобождаются в цитоплазму без изменения.

Эти связанные с цитоплазматической мембраной переносчики, пред-

ставляющие собой белки, называются пермеазами.

Известны два типа процессов переноса растворенных веществ,

осуществляемых пермеазами. Первый тип — облегченная диффузия. Движущей силой этого процесса является разница в концентрации какого-либо вещества по обе стороны мембраны. При этом молекула вещества соединяется с молекулой-переносчиком у наружной поверхности мембраны и образовавшийся комплекс диффундирует через мембрану к ее внутренней стороне. Там он диссоциирует, и освобожденное вещество оказывается внутри клетки. Затем переносчик диффундирует обратно к наружной поверхности и сразу же может присоединить к себе другую молекулу вещества. Облегченная диффузия не требует расхода энергии, если нару-жная концентрация вещества выше внутренней, и вещество, таким образом, перемещается «вниз» по химическому градиенту. Скорость ее зависит от концентрации вещества в наружном растворе. Предполагают, что выход продуктов обмена веществ из микробной клетки осуществляется по типу облегченной диффузии и проходит при участии переносчиков.

Второй тип процесса транспорта веществ пермеазами называется

активным переносом. В этом случае растворенные вещества переносятся в клетки микроорганизмов «вверх» по химическому градиенту (или, как говорят, против градиента концентрации). Считают, что большинство веществ проникает в клетку микроорганизма в результате активного переноса. Подобный транспорт веществ нуждается в энергии (АТФ), получаемой в результате дыхания или брожения. При отсутствии источников энергии накопления веществ внутри цитоплазмы не происходит.

В норме у бактериальных клеток всегда наблюдается определенное напряжение цитоплазмы, объясняющееся осмотическим давлением клетки, при котором цитоплазма плотно прижата к оболочке. Такое постоянное напряжение клеточного содержимого называется тургором и является одним из необходимых условий роста клетки. Величина осмотического давления у бактерий колеблется в пределах 6∙105 Па.

При увеличении концентрации питательного раствора (поваренной соли или сахара) бактериальная клетка обезвоживается, цитоплазма ее сокращается и отходит от оболочки, клетка переходит в состояние расслабления и вялости. Такое явление называется плазмолизом.

Если концентрация раствора значительно ниже концентрации содержимого клетки (дистиллированная вода), наступает процесс, обратный плазмолизу – плазмоптиз. Вода проникает в бактериальную клетку, ее содержимое разбухает, форма меняется. Плазмоптиз, так же как и плазмолиз, приводит к гибели бактериальной клетки.

Как и во всех живых организмах, основную часть микробной клетки составляет вода (80-90% общей массы клетки). Элементарный состав клеток

микроорганизмов характеризуется следующими данными (в % от массы сухого вещества): углерод - 50, кислород - 20, азот - 14, во-дород - 8, фосфор

- 3, сера - 1, калий - 1, натрий - 1, кальций - 0,5, магний-0,5, хлор - 0,5, железо

- 0,2, другие элементы - 0,3.

Некоторые микроорганизмы для развития требуют дополнительные

вещества называемыми ростовыми, или факторами роста. В эту группу веществ входят витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, органические кислоты.

Микроорганизмы, нуждающиеся в факторах роста, называются

ауксотрофными, а не нуждающиеся - прототрофными. Ауксотрофными чаще всего являются мутанты прототрофов, которые можно получить из прототрофов путем искусственного мутагенеза. Ауксотрофы отличаются от исходных прототрофов потребностью в определенных факторах роста. Они растут на сложных естественных средах, в состав которых вводится дрожжевой экстракт или (для определенных ауксотрофов) кукурузный экстракт. Если микроорганизм неспособен синтезировать то или иное соединение, оно становится для него незаменимым фактором роста.

Ростовые вещества нужны микроорганизмам в ничтожных количествах

(мкг/л). Они чаще всего входят в состав ферментов и поэтому играют незаменимую роль в физиологии микробной клетки.

1.3 Метаболиз микроорганизмов. Попав внутрь клетки микроор-

ганизма, питательное вещество участвует во множестве разнообразных химических реакций; эти реакции, а также все остальные химические проявления жизнедеятельности микроорганизмов носят общее название обмена веществ или метаболизма. Обмен веществ состоит из двух групп жизненно важных процессов - катаболизма и анаболизма.

Катаболизм (диссимиляция, энергетический обмен) - это процессы распада пищевых веществ - углеводов, жиров и белков, которые осуществляются в основном за счет реакций окисления. У микроорганизмов различают две основные формы катаболизма - дыхание и брожение. При дыхании происходит полное разрушение органических веществ с выходом большого количества энергии и образованием бедных энергией конечных продуктов (СО2 и Н2О). При брожении осуществляется неполный распад органических веществ с высвобождением незначительного количества энергии и накоплением богатых энергией конечных продуктов (этилового спирта, молочной, масляной и других кислот). Высвобождающаяся при катаболизме органических веществ свободная энергия аккумулируется в форме энергии фосфатных связей аденозинтрифосфата (АТФ).

При аэробном дыхании акцептором водорода является кислород, при анаэробном - неорганические окисленные соединения типа нитратов, сульфатов, при брожении - органические соединения.

Анаболизм (ассимиляция, конструктивный обмен) объединяет процессы синтеза макромолекул (нуклеиновых кислот, белков, полисахаридов и т. д.) из более простых соединений. Процессы синтеза связаны с потреблением

свободной энергии, которая вырабатывается в результате дыхания или брожения и поставляется в форме АТФ. Катаболизм и анаболизм протекают одновременно, многие реакции и промежуточные продукты являются для них общими и осуществляются с помощью ферментов. Ферменты биологические катализаторы. Они катализируют тысячи химических реакций, из которых слагается обмен веществ микроорганизма. В настоящее время известно около тысячи ферментов. Согласно разработанной Международной комиссией по ферментам новой классификации и номенклатуре ферментов, они подразделяются на шесть главных классов: оксидоредуктазы,

трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы.

Вопросы для самопроверки

1. Понятие о прокариотах

2. Понятие о эукариотах

3. Классификация микроорганизмов

4. Основные группы микроорганизмов

5. Питание микроорганизмов

6. Дыхание микроорганизмов

7. Метаболизм микроорганизмов

ГЛАВА 2. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

МИКРООРГАНИЗМОВ

2.1 Виды питательных сред. Под культивированием понимают

выращивание определенного вида, типа или клона микроорганизма, или

смеси разных микроорганизмов на питательных средах.

Для выращивания бактерий применяют различные питательные среды. Они могут быть жидкими, твердыми (лучше называть их плотными) или полужидкими. Жидкие среды готовят на основе водных растворов какихлибо веществ, чаще всего мясной воды, различных гидро-лизатов, иногда жидких естественных продуктов (молока, крови и др.). Для получения плотных сред к ним добавляют или агар, или желатин, или силикагель в соответствующих концентрациях. Агар представляет собой полисахарид сложного состава, получаемый из морских водорослей. Он имеет плотную волокнистую структуру. Агар плавится при 100°С, но при охлаждении сохраняет жидкую консистенцию до 45°С. Для получения плотных сред его добавляют в концентрации 1,5-3,0%. Полужидкие среды имеют вязкую консистенцию благодаря добавлению к ним небольшого количества агара (0,3-0,7%). По происхождению среды делят на естественные (кровяные, молочные, картофельные, яичные) и искусственные, получившие особенно широкое распространение. Они представляют собой искусственные сбалансированные смеси питательных веществ в концентрациях и сочетаниях, необходимых для роста и размножения микроорганизмов. В них в качестве универсального источника азота и углерода для патогенных бактерий применяют пептоны - продукты неполного расщепления белков с помощью ферментов (пепсина), различные гидролизаты (рыбный, казеиновый, дрожжевой и т. п.). Питательные среды должны обязательно отвечать трем основным требованиям:

1) они должны содержать в достаточном количестве все необходимые питательные вещества (источники энергии, углерода, азота), соли и ростовые факторы;

2) должны иметь оптимальную для роста данного вида бактерий рН;

3) должны иметь достаточную влажность (при их усыхании повы-

шается концентрация питательных веществ, особенно солей, до уровней, тормозящих рост бактерий).

Кроме того, питательные среды для лучшего определения культу-

ральных свойств бактерий должны быть по возможности прозрачными. Наконец, они должны быть стерильными, не содержать посторонней микрофлоры. По назначению питательные среды подразделяют на следующие основные категории.

Универсальные- среды, на которых хорошо растут многие виды пато-

генных и непатогенных бактерий. К ним относятся: мясопептонный бульон

(МПБ = мясная вода + 1% пептона + 0,5% NaCl), мясопептонный агар (МПА = МПБ + 2-3% агара).

Дифференциально-диагностические- среды, позволяющие отличать одни виды бактерий от других по их ферментативной активности или культуральным проявлениям. К ним относятся среды Эндо, Левина, Плос-кирева, Гисса и многие другие.

Селективные (синонимы: избирательные, элективные, обогатитель- ные) — среды, содержащие вещества, используемые микроорганизмами определенных видов и не благоприятствующие или даже препятствующие росту других микроорганизмов. Селективные среды позволяют направленно отбирать из исследуемого материала определенные виды бактерий. Сюда относятся среды Мюллера, Кауфмана, селенитовая, Рапопорт, 1%-ная пептонная вода, Китт-Тароцци и др.

Синтетические- среды строго определенного химического состава, представляющие собой растворы неорганических солей с добавлением химических соединений, которые служат источником углерода или азота. Примером такой синтетической среды является минимальная среда М-9, в которой источником энергии и углерода является глюкоза, а азота - NH4C1. Синтетические среды могут быть и более сложного состава с включением различных аминокислот, оснований и витаминов.

Полусинтетические- синтетические среды, к которым добавляют какой-либо продукт природного происхождения, например сыворотку крови. Существует много различных вариантов питательных сред, сконструированных с учетом потребностей соответствующих видов бактерий и диагностических целей.

2.2 Способы культивирования микроорганизмов.

В зависимости от способа культивирования различают периодические (стационарные и при глубинном культивировании) и непрерывные (при проточном) культуры бактерий.

Стационарный способ: питательные среды сохраняются пос-тоянными, с ними никаких дополнительных манипуляций не производят. Однако при таком способе культивирования в жидких питательных средах, где преобладают анаэробные энергетические процессы, выход биомассы незначителен. Поэтому в связи с развитием микробиологической про-мышленности были разработаны принципиально новые способы культивирования, позволяющие получать гораздо больший выход биомассы или биологически активных соединений. К их числу относятся метод глубинного культивирования с аэрацией и метод использования проточных сред.

Поверхностный метод культивирования. Культура растет на по- верхности твердой увлажненной питательной среды. Клетки получают питание за счет содержащихся в этих средах веществ и используют для дыхания кислород воздуха, поэтому для их нормального обеспечения кислородом приходится применять рыхлые по своей структуре среды с небольшой высотой слоя.

Недостатком метода является необходимость больших площадей для

выращивания. Выращивание производственной культуры происходит обычно в не асептических условиях. Однако среда и кюветы должны быть надежно стерилизованы.

Главное преимущество поверхностного метода - низкая потребность

электроэнергии по сравнению с глубинным методом.

Метод глубинного культивирования с аэрацией. Для выращивания с помощью этого способа применяют специальные устройства - реакторы. Они представляют собой герметические котлы (приспособленные автоклавы), в которые заливается жидкая питательная среда. Реакторы снабжены автоматическими приспособлениями, позволяющими поддер-живать постоянную температуру, оптимальные рН, дозированное поступление необходимых дополнительных питательных веществ. Однако главная особенность таких реакторов в том, что они постоянно продуваются стерильным воздухом и в них установлены мешалки, с помощью которых среда постоянно перемешивается. Поэтому во всей питательной среде создается такая концентрация свободного кислорода, при которой энергетические процессы происходят в аэробных условиях, т. е. достигается максимальное использование энергии, заключенной в глюкозе, а следовательно, и максимальный выход биомассы.

Глубинное культивирование проводят в реакторах в герметичных котлах с жидкой питательной средой, оборудованных автоматическими приспособлениями для контроля рН, О2, температуры, поступления стерильного воздуха и т.д. В аэробных условиях достигается максимальное использование энергии и максимальный выход биомассы. Выход биомассы бакьерий при культивировании в стационарных условиях через 18 20 ч 109КОЕ, а при глубинном способе через 12 14 ч 50- 60 109 КОЕ.

Весь процесс должен проводиться в строго асептических условиях, что с одной стороны, является преимуществом метода, а с другой - составляет наибольшую техническую трудность, т.к. нарушение асептики часто приводит к прекращению роста культур.

Проточный способ культивированияпозволяет создать условия, при которых клетки имеют возможность длительное время находиться в определенной фазе роста (экспоненциальной) при постоянной концентрации питательных веществ и в одних и тех же условиях, обеспечивающих непрерывный рост культуры. Методы получения непрерывных культур основаны на том, что в аппарат, где растут клетки, непрерывно добавляют свежую питательную среду и одновременно из него удаляют соответствующее количество бактерий.

2.3 Биотехнологические процессы воспроизводства микрооргнизмов

включают периодические или непрерывные процессы.

Биореактор, ферментер или ферментатор - это закрытая или ОТКрыта емкость, в которой при определенных условиях (давление, температура, концентрация сухих веществ, рН среды и т.д.) протекает на клето-

чном или молекулярном уровне контролируемая реакция, осуществляемая с помощью микроорганизмов.

Периодический процесс включает: а) стерилизацию сред, биореак-

торов и вспомогательного оборудования; б) загрузку аппарата питательной средой; в) внесение посевного материала (клеток, спор); г) рост культуры, который может совпадать во времени со следующим этапом или предшествовать ему; д) синтез целевого продукта; е) отделение и очистку готового продукта. Речь идет о временной последовательности этапов, по окончании последнего этапа проводится мойка биореактора и его подготовка к новому циклу.

Этап роста культуры включает несколько фаз: а) лаг-фазу – срав-

нительно медленный рост внесенной культуры, осваивающей новую среду обитания в объеме биореактора; б) экспоненциальную фазу - бурное деление клеток, сбалансированный рост культуры; в) фазу замедленного роста, связанного с исчерпанием питательных субстратов и накоплением токсических продуктов метаболизма; г) стационарную фазу - прирост клеток равен их убыли; д) фазу отмирания - постепенное снижение числа жизнеспособных клеток.

Биотехнологически ценные продукты синтезируются в

экспоненциальную фазу (нуклеотиды, многие ферменты, витамины - так называемые первичные метаболиты) или в стационарную фазу роста (антибиотики, красящие вещества и т.д. — так называемые вторичные

метаболиты или идиолиты).

Широко применяют периодическое культивирование с подпиткой: помимо внесения питательного субстрата в реактор до введения в него биообъекта, в процессе культивирования в аппарат добавляют питательные вещества через определенные промежутки времени порциями или непрерывно «по каплям». Иногда дополнительно вносят биообъект.

Существует также отьемнодоливочное культивирование, когда часть объема из биореактора время от времени изымается при добавлении эквивалентною объема среды. Это приводит к регулярному омолаживанию культуры и к задержке ее перехода к фазе отмирания. Такой режим культивирования в значительной мере уподобляется непрерывному процессу, поэтому называется также полунепрерывным куль-тивированием.

В непрерывных процессах биообъект постоянно поддерживается в экспоненциальной фазе роста. Обеспечивается непрерывный приток свежей питательной среды в биореактор и отток из него культуральной жидкости, содержащей клетки и продукты их жизнедеятельности. Фундаментальным принципом непрерывных процессов служит равновесие между приростом биомассы за счет деления клеток и их убылью в результате разбавления свежей средой.

Вопросы для самопроверки

1.Понятие о культивировании микроорганизмов

2.Виды питательных сред

3.Способы культивирования микроорганизмов

4.Виды биотехнологических процессов

3.ГЛАВА ХРАНЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

Несмотря на постоянное углубление наших знаний в области генетики, биохимии, физиологии и экологии микроорганизмов, мы все еще далеки от понимания полной картины о процессах, ответственных за обратимый переход клеток микроорганизмов в анабиотическое состояние. Примерно за 60-летнюю историю активного изучения мира микроорганизмов и создания их коллекций накопились достаточно общие, но все еще не вполне четкие, по нашему мнению, представления по управлению процессами консервации и восстановления жизнеспособности каждого конкретного организма. Сопоставляя количество вновь открываемых или создаваемых рекомбинантных микроорганизмов с весьма немногочисленными приемами их хранения, основанными на общебиологических представлениях о строении и физиологии микробных клеток, становится понятным явное отставание знаний в области конкретных подходов. Богатый опыт работы с коллекциями микроорганизмов свидетельствует о том, что ряд современных методов консервации оказывается относительно эффективным при поддержании лабораторных культур микроорганизмов. Однако эффективная консервация с полным сохранением популяций и геномов представляет собой проблему, особенно если учесть необычайное физиологическое разнообразие микроорганизмов, а также то, что способность сохранять жизнеспособность в определенных условиях оказывается связана не только с родом и видом микроорганизма, но не-редко с его расой. Поэтому, как бы ни был ценен эмпирический опыт по поддержанию культур, актуальной остается и попытка анализа природных процессов, в ходе которых многие микроорганизмы успешно сохраняются в природе, несмотря на весьма жесткие там условия, отнюдь не способствующие активной их жизнедеятельности. Механизмы этих процессов в отдельных более хорошо изученных случаях столь эффективны, что обеспечивают сохранение микроорганизмами жизнеспособности и генетической стабильности в течение весьма длительных сроков. В целом практика консервации, развивавшаяся на протяжении многих десятилетий, эмпирически выработала ряд приемов, в различной степени соответствующих тем механизмам погружения клеток в анабиотическое состояние, которые были выявлены (и продолжают выявляться) при изучении образования, свойств и прорастания специализированных покоящихся клеток микро-организмов.

Существующая практика консервации ориентируется обычно на задачу создания по возможности немногочисленных и специализированных приемов, позволяющих перевести в анабиотическое состояние вегетативные клетки разнообразных микроорганизмов.

По современным сведениям, более 99 % микроорганизмов, обитающих в окружающей среде, плохо культивируются в искусственных условиях. Это так называемые некультивируемые микроорганизмы, исследование которых сопряжено с необходимостью их сохранения, что предполагает соответствующие работы по выбору условий консервации-реактивации.

Поддержание штаммов в рабочем состоянии, сохранение их ценных

свойств являются важными условиями практически любой работы с микроорганизмами - от первичного изучения до использования их в производстве различных биопрепаратов.

3.1 Методы хранения микроорганизмов Методы непродолжительного хранения микроорганизмов

Методы непродолжительного хранения являются одними из самых

простых, не требующих дорогостоящего оборудования и в то же время незаменимых в повседневной работе с микроорганизмами.

- Субкультивирование, или метод перевиваемых культур

Субкультивирование, или периодический пересев на свежие агаризо-

ванные среды, относится к старейшим и давно уже ставшим традиционными методам поддержания и сохранения бактериальных культур как в лабораторных, так и промышленных условиях. Интервал между пересевами зависит от микроорганизма, используемой среды, температурных условий хранения.

- Поддерживающая среда. Предпочтительнее использовать

минимальные среды, поскольку в них процессы метаболизма в микроорганизмах идут с пониженными скоростями и поэтому промежутки между пересевами удлиняются. Однако для роста некоторых бактерий требуются комплексные среды. Или же для сохранения их специфических физиологических свойств необходимо присутствие в среде сложных соединений. При использовании комплексной среды могут потребоваться более частые пересевы, связанные с ускоренным ростом бактерий или накоплением конечного продукта метаболизма.

- Температура хранения. Допускается хранение культур микро-

организмов при комнатной температуре в закрытом контейнере. Для уменьшения высыхания культур используют пробирки с завинчивающимися крышками или резиновые пробки либо обычные ватномарлевые пробки, которые обертывают парафильмом и помещают в полиэтиленовый пакет. Чтобы уменьшить скорости метаболизма микроорганизмов, культуры лучше хранить в бытовом холодильнике при температуре 5-8 °С. Используя эти меры предосторожности, можно сохранять большинство бактерий в течение

3-5 месяцев без пересева .

- Режим пересевов. Частоту пересевов определяют эксперимен-

тальным путем, стараясь проводить их как можно реже во избежание селекции вариантов. На случай потери культуры желательно сохранять ее дубликаты.

После каждого пересева культуру проверяют на чистоту и периодически проводят сокращенную проверку для выявления каких-либо изменений в фенотипических свойствах бактерий. В пересеваемых культурах не следует выделять единичные колонии, поскольку при этом повышается вероятность селекции мутантов.

<<< < Предыдущая 12 / 172 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]