Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Моделирование и масштабирование биотехнологических процессов. Учебное пособие для студентов магистратуры по направлению подготовки 19.04.01 «Биотехнол

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

07.09.2026

Размер:

1 Мб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 5 67 / 127 8 9 10 11 12 > Следующая >>>

4. МОДЕЛИРОВАНИЕ КИНЕТИКИ РОСТА

МИКРООРГАНИЗМОВ В БИОРЕАКТОРАХ

НЕПРЕРЫВНОГО ДЕЙСТВИЯ

При периодическом культивировании в полной мере способность микроорганизмов к максимальному размножению не используется. Период самой активной жизнедеятельности – экспоненциальная фаза – занимает лишь небольшую часть производственного цикла, а значительная часть времени уходит на лаг-фазу и период замедленного роста.

При периодическом культивировании клетки все время находят-

ся в меняющихся условиях. Вначале в

питательной среде имеются в достаточном количестве все питательные вещества, а затем, постепенно наступает недостаток питания и накопление продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, ингибирующих рост клеток. Если ввести в питательную среду сразу большое количество питательных веществ, то происходит ингибирование роста культуры избытком субстрата. Постепенным введением этого же количества питательных веществ в

течение всего процесса можно избежать ингибирования роста микроорганизмов. Такой метод получил название культивирование микроорганизмов с дробным дозированием субстрата.

При добавлении источников питания в ходе культивирования происходит изменение объема питательной среды. Чтобы сохранить объем среды постоянным и снизить концентрацию продуктов жизнедеятельности микроорганизмов в среде, часть культуральной жидкости можно через определенные промежутки времени удалять из аппарата. Такой периодический процесс культивирования называется

отъемно-доливным.

Отличие отъемно-доливного метода от предыдущего метода заключается в том, что часть культуры периодически удаляется при постепенном поступлении свежей среды. В данном случае основные параметры процесса – объем, скорость разбавления, удельная скорость роста – не являются постоянными, и культура находится в квазистационарном состоянии.

4.1. УСЛОВИЯ НЕПРЕРЫВНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

МИКРООРГАНИЗМОВ

Непрерывное культивирование заключается в непрерывной подаче питательных веществ в биореактор (ферментатор) в таком количественном и качественном соотношении, которое необходимо

для поддержания микроорганизмов в экспоненциальной фазе развития. В этих условиях достигается подвижно-равновесное состояние, при котором клетки непрерывно и однородно размножаются со скоростъю, соответствующей притоку питательных веществ.

Одновременно часть культуральной среды вместе со взвешенными в ней клетками с той же скоростью непрерывно вытекает из ферментатора, однако количество микроорганизмов

, поддержи-

вающее непрерывный процесс, остается в ферментаторе постоянным.

Одной из важных характеристик характеристик непрерывного культивирования является скорость разбавления, т. е. скорость обмена питательной среды в ферментаторе:

D = v/V, (4.1)

где D – скорость разбавления, ч–1; V – объем ферментатора, л; v – скорость поступления среды (скорость протока), л/ч.

Удельная скорость роста микроорганизмов равна (см. уравнение

(2.3))



отсюда мгновенный прирост концентрации микроорганизмов во время культивирования равен Х.

В условиях непрерывного культивирования мгновенный прирост

биомассы Х компенсируется ее уносом со средой DX, т. е. Х – DX = 0 или ( – D) · X = 0. Следовательно,

 = D. (4.2)

Это равенство является основным условием поддержания установившегося режима при непрерывном культивировании микроорганизмов. В этом случае все технологические и физиологические показатели сохраняются постоянными. К технологическим показателям относится концентрация компонентов культуральной жидкости, а к физиологическим – скорость роста клеток и их структурнобиохимические особенности.

Саморегулирующая способность микроорганизмов в процессах непрерывного культивирования. Установившийся (стационар-

ный) режим при непрерывном культивировании, т. е. когда скорость разбавления находится в равновесии с удельной скоростью роста, необходимо контролировать и поддерживать притоком свежей питательной среды.

Однако система непрерывного культивирования микроорганизмов обладает способностью саморегулирования. Саморегулирование проявляется в том, что при изменении состава среды или скорости ее подачи, система выходит из равновесия и возникает ряд взаимосвязанных изменений ее параметров.

Предположим, что скорость разбавления стала меньше удельной скорости роста микроорганизмов, т. е.   D. При этом разность  – D

становится положительной величиной. В связи с этим время пребывания среды в ферментаторе увеличивается и концентрация биомассы Х начинает повышаться, что приводит к убыли питательных веществ и накоплению продуктов обмена.

Все это неблагоприятно отражается на скорости роста, и она начинает падать. Вследствие этого разность  – D стремится к нулю,

а система – к установлению нового подвижного равновесия. При этом концентрация биомассы стабилизируется на новом более высоком уровне по сравнению с первоначальным уровнем, а концентрация субстрата – на более низком уровне.

Если скорость разбавления увеличится и на некоторое время станет выше удельной скорости роста   D, то разность  – D станет

отрицательной величиной и концентрация биомассы в системе начнет снижаться. Питательные вещества меньше расходуются, концентрация их возрастает, что положительно влияет на удельную скорость роста – она увеличивается. В результате система приходит к новому установившемуся режиму, соответствующему более высокой концентрации питательных веществ и более низкой концентрации биомассы.

Таким образом, изменяя скорость потока или состав питательной среды можно переводить систему из одного стационарного состояния в другое. Из этого следует, что непрерывные процессы об-

ладают саморегулирующей способностью при условии   

. Когда

скорость разбавления превысит максимальную удельную скорость роста, то через определенный период времени все микроорганизмы будут вымыты из ферментатора.

4.2. ТЕОРИЯ ХЕМОСТАТНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

При гомогенно-непрерывном культивировании можно осуществить ограничение роста культуры одним элементом питания при нелимитируемых количествах других компонентов. Такое непрерыв-

ное культивирование называется хемостатным, так как рост микроорганизмов регулируют химические факторы среды (рис. 4.1).

Рис. 4.1. Принципиальная схема хемостата:

1 – регулятор подачи лимитирующего компонента; 2 – датчик концентрации лимитирующего компонента; 3 – лимитирующий компонент; 4 – питательная среда; 5 – культуральная жидкость;

6 – аэрация; 7 – перемешивающее устройство

Хемостатная культура представляет собой полностью перемешиваемую суспензию биомассы, в которую с постоянной скоростью подается среда и из которой с той же скоростью отбирается культуральная жидкость вместе с клетками.

Компоненты среды подбирают таким образом, чтобы один элемент питания был в недостатке, тогда плотность популяции определяется его концентрацией. Все остальные элементы питания даются в избытке, а условия культивирования (температура, рН, аэрация) поддерживаются оптимальными.

Скорость разбавления в хемостате заранее задана и контролируется концентрацией лимитирующего компонента. Микроорганизмы в зависимости от этого сами поддерживают собственную концентрацию. Скорость разбавления D можно менять в широких пределах,

но она не должна превышать величину 

Теория хемостатного культивирования. Хемостатное культи-

вирование – это вариант гомогенного непрерывного (проточного) культивирования с заданным коэффициентом разбавления (D). При



этом задается также фактор, который обусловливает ограничение концентрации образующейся в аппарате биомассы. Концентрация биомассы определяется одним определенным компонентом питания. При низком коэффициенте разбавления лимитирование будет значительным, при высоком – относительно слабым.

То же самое наблюдается и в отношении воздействия на микроорганизмы ингибиторов роста: при низком коэффициенте разбавления клетки дольше находятся в среде с ингибитором и его воздействие проявляется в большей степени; при высоком значении D эффект ингибирования менее выражен. Однако при высокой скорости роста клетки могут быть более чувствительны к ингибитору.

Хемостатный метод культивирования незаменим в лабораторных исследованиях физиологии микроорганизмов и клеток тканей. В промышленности он широко применяется в процессах производства микробной биомассы.

Для хемостатной культуры существуют определенные количественные зависимости между концентрацией биомассы Х, концентрацией

субстрата S и скоростью роста . Скорости изменения концентрации биомассы субстрата при хемостатном культивировании определяются следующими уравнениями:



;DXX

(4.3)



;/soYXDSDS

(4.4)



Х/Y

(4.5)



,DP

Х/Y

– биосинтез продукта метабо-

– расход суб-

где S щим фактором; DS

– исходная концентрация субстрата, являющегося лимитирую-

– приток субстрата в ферментатор; DS – унос

неутилизированного субстрата из ферментатора; страта на рост микроорганизмов;

лизма; Y

, YР – экономические коэффициенты по биомассе и продукту

соответственно.

В стационарном состоянии концентрации биомассы и неутили-

зированного субстрата являются постоянными, т. е. при

Х = DX или

 = D концентрация биомассы Х = const и S = const. В этом случае

в соответствии с уравнением Моно зависимости удельной скорости роста микроорганизмов от концентрации лимитирующего субстрата можно записать:



 = D =

(4.5)



Последнее уравнение позволяет вычислить значения стационарных концентраций субстрата и биомассы в зависимости от скорости разбавления:

СТ

(4.7)







. (4.8)







= Ys(So – SСТ) = Y

СТ

В стационарном состоянии

 



 

рост культуры характеризуется

хемостатными кривыми, изображающими зависимость концентрации клеток

Х и концентрации субстрата S от скорости разбавления D.

Соответствующие графики зависимостей стационарных концентраций субстрата и биомассы от скорости разбавления (хемостатные кривые) приведены на рис. 4.2.

Концентрация субстрата и биомассы, г/л

Рис. 4.2. Зависимости стационарных концентраций биомассы (1)

субстрата (2) и производительности (3) от скорости разбавления:

1 – биомасса; 2 – субстрат; 3 – производительность по биомассе

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Из графиков хорошо видно, что с ростом скорости разбавления значения стационарных концентраций биомассы уменьшаются. При







определенном значении D, называемом критической скоростью разбавления разбавления (

), микроорганизмы вымываются из аппарата,

кр

при этом значение стационарной концентрации субстрата достигает величины

, т. е. становится равной концентрации субстрата, вводи-

мого в аппарат.

Величина критической скорости разбавления определяется

выражением

Это значение близко величине

= 

кр

/ (Ks + S

mSo

). (4.9)



, однако, в условиях хемостат-

ного культивирования биомасса вымывается из ферментатора при несколько меньшей скорости разбавления.

Производительность ферментатора по биомассе определяется уравнением (кривая

3 рис. 4.2)

П = DX. (4.10)

Видно, что при определенной скорости разбавления (протока)

производительность хемостата по биомассе имеет максимальное

опт

значение П = П равенства нулю производной

. Величину D

max

можно определить из условия

опт

dП/dD (dП/dD = 0). Можно показать,

что в этом случае

определяется выражением

опт

SSmO

2/1



SKKD

 (4.11)

./1

Таким образом, определив основные параметры, характеризующие культуру микроорганизмов (

, Ks, Ys), можно рассчитать ста-

ционарные концентрации субстрата и биомассы, а также величину производительности аппарата для любых возможных значений скорости разбавления.

Аппаратура для хемостатного культивирования в лабораторных условиях обычно включает ферментатор емкостью от 0,5 до 2,0 л или больше, имеющий систему термостатирования, снабженный мешалкой с регулируемым числом оборотов и подачей воздуха с регулируемой скоростью.

Кроме того, ферментатор обеспечен электродами для измерения рН с устройством для автоматического поддержания заданного уровня рН; электродами для измерения концентрации в среде кислорода. Показания датчиков температуры, рН и кислорода могут регистрироваться автоматически самописцами или компьютером.

Скорость разбавления задается дозирующим насосом для подачи свежей питательной среды. Иногда применяются дополнительные насосы-дозаторы для подачи некоторых компонентов среды отдельно.



Вся аппаратура размещается на стенде. Такая установка для хемостатного культивирования создает условия для решения различных задач по физиологии и биохимии микроорганизмов.

В зависимости от стоящих вопросов возможно упрощение установки вплоть до использования небольшого стеклянного сосудика с магнитной мешалкой и сосудом Мариотта, обеспечивающими постоянство потока среды. Таким образом, метод хемостатного культивирования в лабораторных условиях позволяет установить особенности физиологического состояния клеток, изучить влияние недостатка компонентов питания, ингибиторов и активаторов роста и многих других факторов.

4.3. СПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ РОСТА

КУЛЬТУРЫ ИЗ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ДАННЫХ

ХЕМОСТАТНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Определение таких параметров как YS, Y

, 

, KS необходимо

при описании роста микроорганизмов в режиме хемостатного культивирования. Наиболее просто могут быть найдены экономические коэффициенты Y

и Y

данным о стационарных концентрациях суб-

страта, продукта метаболизма и биомассы.

может быть найден из уравнения (4.8) как тангенс угла

наклона зависимости X

можно определить из уравнения (4.5). Для стационарного

от (So – S

ст

режима Рст = Xст/YР или YР = Xст/Рст, т. е. этот параметр можно определить как тангенс угла наклона зависимости Xст от Рст.

Предполагается, что экономические коэффициенты Y

и YР

постоянны в течение развития процесса и не зависят от скорости протока (его разбавления).

Параметры 

и KS могут быть найдены из зависимости стацио-

нарной концентрации субстрата от скорости протока (разбавления) по уравнению (4.7). Для этого можно воспользоваться линейными анаморфозами (метод Лайнуивера и Бэрка):

 (4.12)

111



KDKS

или

D = 

– KS (D/Scn). (4.13)



Согласно уравнению (4.12) зависимость 1/Scn от 1/D представляет собой прямую линию с тангенсом угла наклона  каемый на оси ординат, равен –1/KS. Значение



, а отрезок, отсе-

m/KS

может быть найдено

из длины отрезка, отсекаемого прямой на оси абсцисс.

Использование уравнения (4.13) также позволяет графически найти значения  зок, отсекаемый по оси ординат D, дает значение 

и KS. Тангенс угла наклона дает значение KS, отре-

Из отдельно полученных значений Sст хотя бы при двух значениях скорости протока D1 и D2 – соответственно S1 и S2 используя уравнение (4.7) можно вычислить KS :

Аналогично может быть вычислено значение 

= (D1 – D2) / (D2/S2 – D1/S1). (4.14)

Если экспериментально установлены значения стационарных концентраций биомассы Xст в зависимости от скорости протока D, то используя уравнение (4.8) с помощью выше описанных приемов

можно также определить значения YS,

m

, KS.

4.4. ИНГИБИРОВАНИЕ ПРОДУКТАМИ МЕТАБОЛИЗМА

В УСЛОВИЯХ ХЕМОСТАТНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Рассмотрим закономерности культивирования микроорганизмов в хемостате с учетом эффектов ингибирования роста образующимися продуктами метаболизма для двух основных механизмов ингибирования: конкурентного и неконкурентного:

Соответствующая система уравнений аналогична уравнениям (4.3)–(4.5). Удельная скорость роста как функция концентрации субстрата и продукта метаболизма будет иметь вид

– для случая конкурентного ингибирования:



 

 

 



1 S

 

(4.15)

;



– для случая неконкурентного ингибирования:

 (4.16)





1 SK







 





 



В качестве примера, рассмотрим конкурентное ингибирование продуктом в режиме хемостатного культивирования.

В стационар-

ном состоянии в условиях dX/dt = 0, dS/dt = 0, dP/dt = 0 первое уравнение системы уравнений (4.3)–(4.5) может быть представлено в следующем виде:

Учитывая, что Р выражение для Р

 

 

= XСТ/YР = (S0 – SСТ)YS /YР и подставляя это

СТ

в уравнение (4.15) получим выражение

СТ



 



















 

Это уравнение может быть решено относительно S

 



СТ











(4.17)

(4.18)



SSS



CTCT0

СТ





 

(4.19)

SSm

Уравнение (4.19) описывает зависимость стационарной концен-

трации субстрата от концентрации вводимого субстрата S протока D, кинетических параметров  циентов по субстрату и продукту Y

продуктом.

, KS, экономических коэффи-

, YР и константы ингибирования

, скорости

Из этого уравнения следует, что в случае ингибирования продуктом стационарный уровень концентрации субстрата является функцией начальной его концентрации. Это отличает процесс с ингибированием продуктом от процесса с неосложненным ростом.

Очевидно, что поскольку S

≥ S

, то D ≤ 

CТ

S/(KS + S). Отсюда следует,

что существует критическая скорость протока для системы с конкурентным ингибированием продуктом. Эта критическая скорость та же, что и для неосложненного процесса (см. уравнение (4.9)).

Для того чтобы идентифицировать механизм ингибирования и определить все параметры роста культуры микроорганизмов, необходимо провести изучение стационарных уровней субстрата, биомассы или

продукта в зависимости от скоростей протока и начальных

концентраций субстрата.

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 5 67 / 127 8 9 10 11 12 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]