Основы биотехнологии микроводорослей. Учебное пособие для студентов очного и заочного отделений и магистрантов направлений 19.03.01, 19.04.01 «Биотехн

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Тамбовский государственный технический университет»

Д. С. ДВОРЕЦКИЙ, С. И. ДВОРЕЦКИЙ, Е. В. ПЕШКОВА, М. С. ТЕМНОВ, Е. И. АКУЛИНИН

ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

Рекомендовано Учёным советом университета

вкачестве учебного пособия для студентов очного и заочного отделений

имагистрантов направлений 19.03.01, 19.04.01 «Биотехнология», 19.03.02, 19.04.02 «Продукты питания из растительного сырья»

Учебное электронное издание комплексного распространения

Тамбов ♦Издательство ФГБОУ ВПО «ТГТУ»♦

2015

1

УДК 577.3(075.8) ББК Л791я73/Д-243

Д24

Рецензенты:

Доктор технических наук, профессор, заведующий кафедрой «Химия и химические технологии»

ФГБОУ ВПО «ТГТУ»

А. И. Леонтьева

Доктор технических наук, профессор, заместитель директора по научной работе ФГБНУ «ВНИИТиН»

С. А. Нагорнов

Дворецкий, Д. С.

Д24 Основы биотехнологии микроводорослей [Электронный ресурс] : учебное пособие для студентов очного и заочного отделений и магистрантов направлений 19.03.01, 19.04.01 «Биотехнология», 19.03.02, 19.04.02 «Продукты питания из растительного сырья» / Д. С. Дворецкий, С. И. Дворецкий, Е. В. Пешкова, М. С. Темнов, Е. И. Акулинин. – Тамбов : Изд-во ФГБОУ ВПО «ТГТУ», 2015. – 1 электрон. опт. диск (CD-ROM). – Системные требования : ПК не ниже класса

Pentium II ; CD-ROM-дисковод 00,0 Mb; RAM ; Windows 95/98/XP ;

мышь. – Загл. с экрана. ISBN 978-5-8265-1495-5.

Посвящено биотехнологическим аспектам применения микроводорослей. Представлены разделы, посвящённые систематике водорослей, физиологическим и биохимическим основам жизнедеятельности водорослевых организмов. Показаны особенности биотехнологии микроводорослей, позволяющей получать различные продукты – от кормов для животных до технических липидов. Представлено существующее оборудование для культивирования микроводорослей и технологические особенности извлечения внутриклеточных продуктов метаболизма микроводорослей.

Предназначено для студентов очного и заочного отделений и магист-

рантов направлений 19.03.01, 19.04.01 «Биотехнология», 19.03.02, 19.04.02 «Продукты питания из растительного сырья».

УДК 577.3(075.8) ББК Л791я73/Д-243

Все права на размножение и распространение в любой форме остаются за разработчиком. Нелегальное копирование и использование данного продукта запрещено.

2

ВВЕДЕНИЕ

Водоросли являются одним из самых распространённых организмов на планете. Их повсеместная распространённость – от горячих источников до льдов Антарктиды и от морских глубин до высокогорных снегов – объясняется их исключительной приспособленностью и жизнестойкостью. В жизни Земли они играли и играют значительную роль: являются создателями земной атмосферы, первыми растительными организмами, основоположниками органического вещества на планете, участвуют в глобальном круговороте углерода и азота, лежат в основании пищевых цепей. Всё это стало возможным благодаря уникальной физиологической особенности водорослей – способности к автотрофной ассимиляции или фотосинтезу. Содержащийся в их клетках хлорофилл позволяет водорослям строить органические вещества своего тела из неорганических веществ и воды, используя энергию солнечного света. Механизм биохимических процессов, протекающих в клетках водорослей, очень чётко отлажен, высокоэффективен и позволяет клеткам быстро размножаться и исключительно легко приспосабливаться к непрерывно меняющимся условиям внешней среды.

Применение водорослей в качестве объекта биотехнологии является привлекательной и перспективной задачей. Водоросли уже давно и успешно применяются в различных отраслях человеческой деятельности – от пищевых и кормовых добавок до строительных и технических материалов. Особенно привлекательным в настоящее время выглядит использование биомассы различных альгокультур как источника энергетического сырья в производстве биотоплива III поколения.

Реализация биотехнологии микроводорослей требует глубоких знаний их физиологических и биохимических особенностей, основных принципов организации биотехнологических процессов, наиболее эффективных способов обработки биомассы и соответствующее аппаратурное оформление.

Данное пособие включает в себя разделы, посвящённые систематике водорослей, физиологическим и биохимическим основам жизнедеятельности водорослевых организмов. Показаны особенности биотехнологии микроводорослей, позволяющей получать различные продукты – от кормов для животных до технических липидов. Представлено существующее оборудование для культивирования микроводорослей и технологические особенности извлечения внутриклеточных продуктов метаболизма микроводорослей.

Пособие предназначено для студентов и магистрантов, обучающихся по направлению 19.03.01 (19.02.01) «Биотехнология» при изучении дисциплин профессионального цикла, а также при проведении научноисследовательской деятельности.

3

1.ВОДОРОСЛИ. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

1.1.ОСНОВЫ КЛАССИФИКАЦИИ ВОДОРОСЛЕЙ

ИФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВЯЗИ

Водоросли – очень многочисленная и крайне неоднородная в систематическом отношении группа организмов, рассматриваемая большинством систематиков как совокупность нескольких самостоятельных отделов (типов) [1, 2]. В прошлом водоросли считались примитивными растениями (без специализированных проводящих или сосудистых, тканей); их выделяли в подотдел водорослей (Algae), который вместе с подотделом грибов (Fungi) составлял отдел талломных (слоевцовых) или низших растений (Thallophyta), – один из четырёх отделов царства растений. В соответствии с системой, принятой альгологами, водоросли состоят из 11 отделов: Cyanophyta (сине-зелёные водоросли, цианеи), Cryptophyta (криптофиты), Rhodophyta (красные водоросли), Chrysophyta (золотистые водоросли), Bacillariophyta (диатомовые водоросли), Xanthophyta (жёлтозелёные), Dinophyta (перидинеи), Euglenophyta (эвгленовые водоросли), Phaeophyta (бурые водоросли), Chlorophyta (зелёные водоросли), Charophyta (харовые). За основу подразделения водорослей на отделы положены два общих критерия: морфологический (различия в уровне развития и степени дифференциации таллома) и физиологический (различия в пигментном составе).

Степеньродствамеждуотделамиводорослей представлена нарис. 1 [2]. По типу клеточной организации водоросли делятся на прокариот (Cyanophyta), мезокариот (Dinophyta) и самая многочисленная группа

эукариот (остальные отделы) [1, 2].

Эукариоты в свою очередь разделяются по цвету в зависимости от окраски хлоропластов на три ветви, соответственно включающие красные водоросли (Rhodophyta), зелёные водоросли (Euglenophyta, Chlorophyta,

Charophyta) и группу отделов с преобладанием жёлто-бурых пигментов

(Chrysophyta, Xanthophyta, Bacillariophyta, Phaeophyta).

Цвет – достаточно прочная, но не единственная основа для общей классификации этих организмов. Более существенны для выделения различных групп водорослей типы формирования их колоний, способы размножения, особенностихлоропластов, клеточнойстенки, запасных веществ ит.п.

Следует обратить внимание на то, что все отделы водорослей, кроме Charophita и Phaeophyta, включают и одноклеточные формы,

а Euglenophyta, Chrysophyta и Bacillariophyta представлены только этим уровнем организации таллома, причём даже у харовых и бурых водорослей в жизненном цикле сохранились одноклеточные стадии, представленные репродуктивными клетками.

4

Рис. 1. Происхождение и филогенетические связи между отделами водорослей

Эволюция различных отделов водорослей шла параллельно, что привело к появлению сходных ступеней морфологической дифференциации, но только какие-то предки Chlorophyta дали начало наземным хлорофиллоносным растениям. Близкой к Chlorophyta по происхождению, но рано отделившейся и специализировавшейся группой оказались эвгленовые (Euglenophyta), которые в своей эволюции не вышли за пределы монадной (одноклеточной) организации. Наоборот, харовые водоросли обособились от зелёных водорослей тогда, когда среди них появились формы, уже достаточно высокоморфологически дифференцированные.

5

Одноклеточные представители Chlorophyta составляют два хорошо выраженных класса – Volvocophyceae и Chlarococcophyceae. Вольвоксовые водоросли относятся к типичным монадам и лишь при наступлении неблагоприятных условий временно переходят в пальмеллевидное состояние, вызываемое сильным ослизнением клеток, хлорококковые водоросли представлены коккоидными формами, лишёнными жгутиков, а неподвижная стадия у них ограничивается коротким периодом размножения, когда образуются гаметы и зооспоры. Однако наиболее примитивные из числа хлорококковых иногда обнаруживают сходство с вольвоксовыми.

Многоклеточные растения без особого труда можно отличить от многоклеточных животных, но такого нельзя сказать относительно одноклеточных водорослей и животных. Это объясняется тем, что подвижные одноклеточные водоросли обладают признаками, которые свойственны не только растительным, но и животным организмам. Клетки всех эукариот имеют общий план строения и во многом сходный набор органелл (аппарат Гольджи, митохондрии, ядро, эндоплазматическую сеть и т.д.) с одинаковым типом организации. Растительная клетка характеризуется рядом отличительных черт [2]:

1)присутствие хлоропласта, который влияет на ход обменных процессов, приводит к выработке своеобразных в химическом отношении запасных питательных веществ полисахаридной природы и появлению нового набора ферментов;

2)возникновение наружного покрова в виде оболочек. У водорослей, наряду с целлюлозой, в их составе обнаружен пектин, фукоидан и другие полисахаридные соединения.

По этим признакам водоросли, без сомнения, должны быть причислены к растительному царству.

В то же время подвижные клетки некоторых водорослей роднит

содноклеточными животными отсутствие жёсткой оболочки и наличие таких структур, как жгутики, сократительные вакуоли, стрекательные

структуры. Встречаются организмы, которые способны переходить от автотрофного к гетеротрофному типу питания, теряя при этом окраску. В состав водорослей входит некоторое число форм бесцветных жгутиконосцев, произошедших от окрашенных благодаря утрате хлорофилла

(Astasia, Perantma).

Современная распространённая научная точка зрения рассматривает одноклеточные водоросли в качестве неорганизованных растительных организмов (Protophyta), а одноклеточных, соответственно, как наиболее примитивных представителей животного мира (Protozoa), не вкладывая в эти понятия конкретного таксономического смысла, а лишь подчёркивая сходный уровень в развитии биологических систем в двух разных царствах живой природы, рано разделив развивавшихся параллельно.

6

Зелёные водоросли обычно цвета зелёной травы (хотя окраска может варьировать от бледно-жёлтой до почти чёрной), а фотосинтетические пигменты у них такие же, как у обычных растений. Большинство зелёных водорослей – микроскопические пресноводные формы, многие виды растут на почве, образуя на её влажной поверхности напоминающие войлок налёты. Насчитывается несколько тысяч видов зелёных водорослей. Встречаются представители зелёных водорослей одно- и многоклеточные, могут образовывать нити, шаровидные колонии, листовидные структуры и т.д.

Клетки зелёных водорослей подвижные (с двумя жгутиками) или неподвижные. Половое размножение – разных уровней сложности в зависимости от вида. Клетки содержат ядро и несколько чётко оформленных хлоропластов.

Один из хорошо известных родов – плеврококк (Pleurococcus), одноклеточная водоросль, образующая зелёные налёты, часто наблюдаемые на коре деревьев. Широко распространён род Spirogyra – нитчатые водоросли, образующие длинные волокна тины в ручьях и холодных речках. Весной они плавают в виде липких желтовато-зелёных скоплений на поверхности прудов. Cladophora растёт в виде мягких, сильно ветвящихся «кустиков», прикрепляющихся к камням у берегов рек. Basiocladia образует зелёный налёт на спине пресноводных черепах. Состоящая из многих клеток водяная сеточка (Hydrodictyon), обитающая в стоячих водах, по строению, действительно, напоминает «авоську». У некоторых видов клетки соединены в нитчатые колонии. У свободноплавающей колониальной водоросли Scenedesmus серповидные или продолговатые клетки объединены в короткие цепочки. Этот род обычен в аквариумах, где его массовое размножение приводит к появлению в воде зелёного «тумана». Самая крупная зелёная водоросль – морской салат (Ulva), макрофит листовидной формы.

Красные водоросли (багрянки) – морские листовидные, кустистые или корковые макрофиты, обитающие ниже линии отлива. Цвет багрянок преимущественно красный из-за присутствия пигмента фикоэритрина, но может быть пурпурным или синеватым. Некоторые багрянки встречаются в пресной воде, главным образом, в ручьях и прозрачных быстрых речках. Batrachospermum – студенистая на ощупь, ветвистая водоросль, состоящая из буроватых или красноватых, похожих на бусины клеток. Lemanea – щётковидная форма, часто растущая в быстро текущих речках и водопадах, где её талломы прикрепляются к камням. Audouinella – нитчатая водоросль, встречающаяся в мелких речках. Ирландский мох (Chondrus cripus) – обычный морской макрофит. Багрянки не образуют подвижных клеток. Их половой процесс очень сложен, и один жизненный цикл включает несколько фаз.

7

Бурые водоросли – обитатели моря. Лишь немногие виды микроскопические, а среди макрофитов встречаются самые крупные водоросли в мире. К последней группе относятся ламинарии, макроцистисы, фукусы, саргассумы и лессонии («морские пальмы»), наиболее обильные по побережьям холодных морей. Все бурые водоросли многоклеточные. Цвет их варьирует от зеленовато-жёлтого до тёмно-коричневого и обусловлен пигментом фукоксантином. Половое размножение связано с образованием подвижных гамет с двумя боковыми жгутиками. Экземпляры, образующие гаметы, часто совершенно не похожи на организмы того же вида, размножающиеся только спорами.

Диатомовые водоросли (диатомеи) объединяют в класс

Bacillariophyceae, который в используемой здесь классификации входит вместе с золотистыми и жёлто-зелёными водорослями в отдел (тип) Chrysophyta. Диатомеи – весьма обширная группа одноклеточных морских и пресноводных видов. Окраска клеток диатомей варьируется от жёлтой до бурой из-за присутствия пигмента фукоксантина. Протопласт диатомей защищён коробчатой кремнеземной (стеклянной) оболочкой – панцирем, состоящим из двух створок. Твёрдая поверхность створок часто покрыта характерным для вида сложным узором из штрихов, бугорков, ямок и гребней. Эти панцири – одни из самых красивых микроскопических объектов, а чёткость различения их узора используется иногда для проверки разрешающей силы микроскопа. Обычно створки пронизаны порами или имеют щель, называемую швом. В клетке находится ядро. Помимо деления клеток надвое известно и половое размножение. Многие диатомеи являются свободноплавающими формами, но некоторые прикреплены к подводным объектам слизистыми ножками. Иногда клетки объединяются в нити, цепочки или колонии. Различают два типа диатомей: перистые, с удлинёнными двусторонне-симметричными клетками (они наиболее обильны в пресных водах) и центрические, клетки которых, если смотреть со створки, выглядят округлыми или многоугольными (их больше всего в морях). Панцири диатомей сохраняются после смерти клеток и оседают на дно водоёмов, с течением времени образуя пористую горную породу – диатомит [1, 2].

1.2. ОСНОВЫ ФИЗИОЛОГИИ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ. ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ КЛЕТОК МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

Клетки микроводорослей по строению похожи на клетки растений, однако у них имеются специфические особенности, обусловленные специфичностью среды обитания и обмена веществ [1 – 4]. Уникальными особенностями клеток микроводорослей обладают клеточные покровы, которые представляют собой многослойные, сложно организованные структуры [2, 5], и включают структуры: плазмалемму, перипласт, клеточную оболочку и др.

8

Плазмалемма. У водорослей содержимое клетки (протопласт) снаружи ограничивается тонким, порядка 60…100 А белково-липидным слоем, обладающим специфическими свойствами, который сам по себе не способен фиксировать форму клетки и который получил название плазматической мембраны, или плазмалеммы.

На поперечных срезах плазмалемма представляется гладким образованием, обнаруживает трёхслойную организацию. На внутренней, обращённой к цитоплазме поверхности плазмалеммы, удалось выявить многочисленные глобулярные частицы и углубления, или складки, которые имеют белковую природу и выполняют транспортную функцию.

Перипласт у водорослей представляет собой плотное многослойное образование, состоящее преимущественно из белковых соединений, разрушающихся под действием пепсина и трипсина, причём один слой располагается над плазмалеммой, а другой под ней, и по толщине (порядка 75 А) они между собой не отличаются. Перипласт, толщина которого равна приблизительно 250 A, состоит из серии полос, направляющихся прямыми, продольными рядами от переднего к заднему концу клетки, где они обычно значительно сужаются. В областях контакта полос друг с другом образуются глубокие борозды. Чередование гребней и борозд придаёт клетке рельефный контур. В местах расположения гребней и борозд области перипласта отличаются по своей прочности, и более слабые из них обеспечивают клетке гибкость и позволяют в какой-то мере менять форму. Перипласт пронизан порами, через которые клетка сообщается с внешней средой.

Клеточная оболочка, состоящая из целлюлозы, наиболее удачно сочетает защитную и опорную функции с ростовыми процессами и проницаемостью, поэтому такого рода покров становится господствующим у большинства растений.

Толщина оболочки сильно варьирует в зависимости от видовой принадлежности организма, его возраста, функционального состояния и условий окружающей среды. Покоящиеся клетки имеют более толстые оболочки по сравнению с репродуктивными и молодыми вегетативными клетками. При дефиците влаги в среде обитания оболочки значительно утолщаются.

У подавляющего большинства водорослей оболочки сплошные, но встречаются и составные – из двух или более частей, как у некоторых диатомовых, жёлто-зелёных и зелёных.

На долю клеточной оболочки в среднем приходится 13…15% сухого веса всей клетки, 7,2% от этого количества составляют жиры, а остальное – белки и углеводы. В клеточной оболочке у Chlorella жиров содержится около 9%, а у Anacystis nidulans до 36%, однако основой клеточной оболочки служит белково-углеводный комплекс.

9

Клеточная оболочка представляет собой многослойную структуру. Слои отличаются друг от друга по толщине, плотности, химическому составу, – внутренние слои обычно целлюлозные, а наружный – пектиновый. У некоторых водорослей, таких, например, как Scenedesmus, мощно развитый пектиновый слой, помимо защитной функции, способствующий объединению клеток в колонии.

Уподавляющего большинства водорослей оболочка оказалась двухкомпонентной, состоящей из аморфного основного вещества (матрикса)

ипогружённых в него фибрилл целлюлозной природы с сечением 200…300 А, которые выполняют роль опорного элемента и повышают прочность всей конструкции.

Иногда клеточные оболочки интенсивно пропитываются (инкрустируются) солями железа (у вольвоксовых), кальция (у харовых) или кремния (у диатомовых), которые укрепляют матрикс и нередко создают структуру в виде панциря. Оболочки могут пропитываться не только минеральными солями, но и органическими соединениями, из которых самыми распространёнными оказались лигнин и кутин. Последний, помимо опорной, выполняет ещё и защитную функцию, поскольку он задерживает ультрафиолетовые лучи.

Оболочки некоторых видов водорослей способны выделять и накапливать вещества на поверхности клетки, образуя дополнительный твёрдый покров – кутикулу. Этот процесс называется адкрустацией. Подобного рода структуру имеют вегетативные клетки Porphyra, Oedogonium, эпидермальные клетки бурых водорослей. У красных водорослей на поверхности оболочек адкрустируются содержащие сульфатные группы полисахариды. Их пополнение идёт непрерывно, поэтому они скапливаются в таком большом количестве, что образуют вокруг клетки мощную капсулу в виде слоистого чехла, состоящего из аморфного вещества. Водоросли, вырабатывающие подобного рода полисахариды, являются ценным сырьём для получения агар-агара.

Умногих водорослей, особенно из числа одноклеточных, на поверхности оболочки появляются различного рода дополнительные структуры – щетинки, шипики, чешуйки. Роль этих структур заключается в выполнении защитной функции или поддержании клетки в состоянии парения.

Поскольку микроводоросли представляют собой эукариотические организмы, строение и структура органелл клеток является сложной. Как и большинству клеток животных, растений, клетки микроводорослей содержат структуры, общие для этих царств – ядро, митохондрии, аппарат Гольджи, эндоплазматическая сеть и др. [2].

Ядро и аналоги. У прокариотических сине-зелёных водорослей данная структура представлена нуклеоидом, у мезокариотических динофлагеллат – слабо дифференцированными хромосомами, у эукариотических водорослей – структурно оформленными хромосомами [2, 5].

10