Основы биотехнологии микроводорослей. Учебное пособие для студентов очного и заочного отделений и магистрантов направлений 19.03.01, 19.04.01 «Биотехн

В изучение процесса фотосинтеза, раскрытие его механизма большой вклад внесли: русский учёный К. А. Тимирязев, американский М. Кальвин, австралийские М. Д. Хетч и К. Р. Слэк, а также белорусские учёные академики Т. Н. Годнев и А. А. Шлык.

2.2. ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН В КЛЕТКАХ

Энергетический обмен в клетках любых организмов подразумевает высвобождение потенциальной энергии химических связей органических или неорганических веществ. Будучи заключённой в химических связях различных веществ, энергия недоступна для непосредственного использования клетками, в том числе и клетками микроводорослей и растений, которые преобразовали эту энергию из световой в химическую. Для этого потенциальная энергия органических молекул должна быть высвобождена и переведена в пригодную для использования форму [5, 15].

Образование и накопление энергии, доступной клетке, происходит в процессе клеточного дыхания. Для осуществления клеточного дыхания большинству организмов необходим кислород – в этом случае говорят об аэробном дыхании или аэробном высвобождении энергии. Однако некоторые организмы могут получать энергию из пищи без использования свободного атмосферного кислорода, т.е. в процессе так называемого анаэробного дыхания (анаэробного высвобождения энергии).

Таким образом, исходными веществами для дыхания служат богатые энергией органические молекулы, на образование которых в своё время была затрачена энергия. Основным веществом, используемым клетками для получения энергии, является глюкоза.

Аэробное (кислородное) дыхание. Процесс аэробного дыхания можно условно разделить на несколько последовательных этапов. Первый этап – подготовительный, или этап пищеварения, включающий в себя расщепление полимеров до мономеров. Эти процессы происходят

впищеварительной системе животных или цитоплазме клеток. На данном этапе не происходит накопления энергии в молекулах АТФ.

Следующий этап – бескислородный, или неполный. Он протекает

вцитоплазме клеток без участия кислорода.

На данном этапе дыхательный субстрат подвергается ферментативному расщеплению. Примером такого процесса является гликолиз – многоступенчатое бескислородное расщепление глюкозы. На промежуточных стадиях гликолиза образуются трёхуглеродные ферменты, используемые для биосинтеза ряда веществ.

В реакциях гликолиза шестиуглеродная молекула глюкозы (С6) расщепляется на две молекулы пировиноградной кислоты (С3). При этом от каждой молекулы глюкозы отщепляется четыре атома водорода, и

31

образуются две молекулы АТФ. Атомы водорода присоединяются к переносчику НАД (никотинамидадениндинуклеотид), который переходит в свою восстановленную форму НАД·Н + Н+ (НАД очень сходен с НАДФ, т.е. с переносчиком атомов водорода при фотосинтезе).

Суммарная реакция гликолиза имеет вид

C6H12O6 + 2АДФ+ 2H3PO4 + 2НАД+ →

→ 2C3H4O3 + 2АТФ+ 2ННА Н+ Н+ +H2O.

Полезный выход энергии этого этапа – две молекулы АТФ, что составляет 40…60% выделившейся энергии рассеивается в виде тепла.

Наиболее важным является кислородный этап аэробного дыхания, т.е. он требует присутствия кислорода. Продукт гликолиза – пировиноградная кислота – заключает в себе значительную часть энергии, и дальнейшее её высвобождение осуществляется в митохондриях.

В аэробных условиях пировиноградная кислота декарбоксилируется (теряет молекулы CO2), соединяется со специфическим коферментом А, образуя комплекс ацетил-КоА, и вовлекается в цикл Кребса.

Цикл трикарбоновых кислот или цикл Кребса – это ключевой этап энергетического обмена всех аэробных организмов. В процессе цикла трикарбоновых кислот выделяется и запасается в клетках не только значительное количество энергии, но также происходит синтез молекулпредшественников, участвующих в других биохимических превращениях, синтезируются важные для жизнедеятельности клетки соединения, такие как аминокислоты, жирные кислоты и т.д. Цикл трикарбоновых кислот был открыт немецким биохимиком Хансом Кребсом, за что его удостоили Нобелевской премией в 1953 г.

Полное сгорание энергетического субстрата подразумевает окисление до CO2 и воды ацетильного остатка, связанного с коферментом А (ацетил-КоА).

У эукариотических организмов все реакции цикла Кребса протекают внутри митохондрий. Данный цикл состоит из восьми последовательных реакций (рис. 7).

Цикл трикарбоновых кислот начинается с присоединения ацетилКоА к оксалоацетату (соль щавелевоуксусной или кетоянтарной кислоты) с образованием соли трикарбоновой лимонной кислоты – цитрата. Затем цитрат претерпевает ряд последовательных превращений, сопровождающихся двумя декарбоксилированиями, т.е. выделением CO2, в конечном итоге приводящим к регенерации оксалоацетата.

Как видно, за один оборот цикла, состоящего из восьми ферментативных реакций, происходит полное окисление одной молекулы ацетилКоА.

32

Рис. 7. Цикл Кребса

Суммарное уравнение цикла трикарбоновых кислот:

2C3H4O3 +6H2O + 8НАД− +2ФАД+ →

→ 6CO2 + 8НАД Н2 +2ФАД Р+ 2ААТФ.

Углекислый газ выделяется из митохондрий в цитоплазму клетки, а затем в окружающую среду.

Для непрерывной работы цикла необходимо постоянное поступление в систему ацетил-КоА, а коферменты (НАД и ФАД), перешедшие в восстановленное состояние, должны снова и снова окисляться. Это окисление осуществляется в системе переносчиков электронов (или в цепи дыхательных ферментов), локализованной в митохондриях.

Атомы водорода, акцептированные НАД и ФАД (кофермент флавинадениндинуклеотид), вступают в цепь реакций, конечный результат которых – синтез АТФ. Синтез АТФ происходит в результате процесса, который называется окислительным фосфорилированием, и протекает

вследующей последовательности (рис. 8):

•атомы водорода отщепляются от НАД и ФАД, захватываются переносчиками, встроенными во внутреннюю мембрану митохондрий, где происходит их окисление:

H → H+ +e− ;

33

•Н+ выносятся переносчиками на наружную поверхность крист, накапливаются в межмембранном пространстве, образуя протонный резервуар;

•электроны (е–) атомов водорода возвращаются по цепи дыхательных ферментов в матрикс и присоединяются к атомам кислорода, который постоянно поступает в митохондрию. Атомы кислорода при этом становятся отрицательно заряженными:

12О2 +е− →О2− ;

• на мембране возникает разность потенциалов. Когда разность потенциалов достигает 200 мВ, начинает действовать протонный канал в молекулах фермента АТФ-синтетазы, которые встроены во внутреннюю мембрану;

• через протонный канал протоны H− устремляются обратно в матрикс митохондрий, создавая высокий уровень энергии, бóльшая часть которой идёт на синтез АТФ из АДФ и фосфорной кислоты, а сами протоны соединяются с отрицательно заряженными частицами кислорода, образуя воду – второй конечный продукт клеточного дыхания:

36АДФ+36H3PO4 + E →36АТФ;

24H+ +12O2− →12H2O.

Рис. 8. Схема переноса протонов и электронов через внутреннюю мембрану митохондрии в ходе кислородного этапа

клеточного дыхания (электронтранспортная цепь)

34

Таким образом, кислород, поступивший в митохондрии, необходим для присоединения электронов, а затем и протонов. При отсутствии кислорода процессы, связанные с транспортом протонов и электронов в митохондриях, прекращаются, а, следовательно, невозможно протекание и бескислородного этапа, так как все переносчики атомов водорода оказываются загруженными.

Аэробное дыхание, включающее бескислородный и кислородный этапы, можно выразить суммарным уравнением

С6H12O6 +6O2 +6H2O +38АДФ+38H3PO4 →

→6CO2 +12H2O +38АТФ.

При распаде молекулы глюкозы высвобождается 200 кДж/ моль и образуется 38 молекул АТФ. В АТФ запасается 55% энергии, остальная рассеивается в виде тепла.

При отсутствии или недостатке кислорода, играющего роль конечного акцептора электронов в кислородном дыхании, цепь передачи электронов через мембрану не осуществляется, а значит, не создаётся протонный резервуар, обеспечивающий энергией синтез АТФ. В этих условиях клетки способны синтезировать АТФ, расщепляя питательные вещества в процессе анаэробного дыхания. Анаэробное дыхание осуществляют многие виды бактерий, микроскопические грибы и простейшие. Некоторые клетки, временами испытывающие недостаток кислорода (например, мышечные клетки или клетки растений), тоже обладают способностью к анаэробному дыханию.

Анаэробное дыхание – эволюционно более ранняя и энергетически менее рациональная форма получения энергии из питательных веществ по сравнению с кислородным дыханием.

В основе анаэробного дыхания лежит процесс, в ходе которого глюкоза расщепляется до пировиноградной кислоты, и высвобождаются атомы водорода. Акцептором атомов водорода, отщепляемых в результате дыхания, является пировиноградная кислота, которая превращается в молочную. Схематически ход анаэробного дыхания можно выразить следующими уравнениями:

Описанный процесс получил название молочнокислого брожения. Молочнокислое брожение осуществляют молочнокислые бактерии (например, кокки из рода стрептококк). Образование молочной кислоты

35

по такому типу происходит также в животных клетках в условиях дефицита кислорода.

В природе широко распространено спиртовое брожение, которое осуществляют дрожжи. В отсутствие кислорода дрожжевые клетки образуют из глюкозы этиловый спирт и СО2. На первых этапах спиртовое брожение идёт аналогично молочнокислому, но последние реакции приводят к образованию этилового спирта. От каждой молекулы пировиноградной кислоты отщепляется молекула СO2 и образуется молекула двууглеродного соединения – уксусного альдегида, который затем восстанавливается до этилового спирта атомами водорода. Суммарное уравнение

C6H12O6 +2АДФ+2H3PO4 → 2C2H5OH +2АТФ+2CO2 .

Спиртовое брожение, кроме дрожжей, осуществляют некоторые анаэробные бактерии. Этот тип брожения наблюдается в растительных клетках в отсутствие кислорода.

Наиболее распространённым питательным веществом, которое используется для анаэробного высвобождения энергии, является глюкоза. Однако следует помнить, что любое органическое вещество при соответствующих условиях может выступать источником энергии для синтеза АТФ.

При недостатке в клетке глюкозы в дыхание могут вовлекаться жиры и белки. Продуктами брожения являются различные органические кислоты (молочная, масляная, муравьиная, уксусная), спирты (этиловый, бутиловый, амиловый), ацетон, а также углекислый газ и вода.

2.3. ПИЩЕВЫЕ ПОТРЕБНОСТИ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

Для роста и размножения микроводорослям необходимы питательные вещества, удовлетворяющие потребности в питательных веществах и энергии. Основными химическими элементами, составляющими 98% структур клеток, являются: углерод, азот, кислород и водород. Эти элементы называются органогенными. Кроме того, клеткам микроводорослей необходимы фосфор, калий, сера, натрий, магний и др. Для нормального роста и функциональной активности клеток микроводорослей необходимо, чтобы все эти элементы регулярно поступали в клетку в требуемых количествах. Важно также, в какой форме химические элементы присутствуют в питательной среде и могут быть усвоены микроорганизмами – органической или минеральной. Микроводоросли, как большинство растительных организмов, по пищевым потребностям являются автолитотрофами [8, 16].

36

Рассмотрим кратко основные пищевые потребности микроводорослей [8].

Источники углерода. Углерод является важнейшим элементом, его доля в составе биомассы составляет около 50%. Поскольку микроводоросли являются автотрофными организмами, они способны использовать в качестве единственного источника углерода диоксид углерода. При этом для интенсивного развития микроводорослей не требуется его принудительная подача в питательную среду.

Источники азота. Большинство микроводорослей являются организмами с белковой направленностью метаболизма, поэтому при культивировании требуют достаточно большого количества азота. Обеспеченностью клеток указанным элементом в значительной степени определяются процессы биосинтеза. Исключение азота из питательной среды быстро приводит к замедлению роста микроводорослей. После истощения внутриклеточных запасов азота синтез биомассы полностью прекращается, снижается синтез белка, интенсивно образуются углеводы (до 50%) и липиды (до 80%) [8]. Регулируя продолжительность культивирования водорослей в безазотной среде, можно получить биомассу с различным соотношением белков, углеводов и липидов. Для обеспечения максимального биосинтеза белков требуется, как правило, более высокий уровень снабжения культур азотом, чем для достижения максимальной продуктивности биомассы. В качестве источника азота, в зависимости от вида микроводоросли, используется нитрат калия, сульфат аммония, нитрат аммония, бикарбонат аммония и мочевина.

Источники фосфора. Фосфор является одним из основных элементов минерального питания и играет важную роль в обмене веществ. При участии фосфора в клетке фотоавтотрофов протекают биохимические реакции азотного и углеводного обмена. Фосфаты образуют в клетках буферные системы, образуя реакцию среды. Фосфор входит в состав соединений, образующих протоплазму и ядро. Водоросли используют

фосфор преимущественно в форме PO34− , HPO24− , H2PO−4 , однако ряд

водорослей, в том числе Scenedesmus и Chlorella, способны использовать фосфор из органических соединений. Поглощение фосфора микроводорослями происходит с затратой энергии, поэтому зависит от фотосинтеза и дыхания. В голодающих по фосфору клетках фосфаты вскоре после их поглощения преобразуются в запасные питательные вещества в виде полифосфатов.

Недостаток фосфора у хлореллы отрицательно сказывается в первую очередь на процессах ассимиляции, тогда как клетки делятся обычно нормально. При недостатке фосфора у Chlorella, Anabaena и Pediastrum наблюдается увеличение относительного содержания углеводов. Отмечено также незначительное снижение количества липидов и изменение их

37

жирно-кислотного состава. При высокой концентрации в среде фосфора обнаружено наибольшее содержание в клетках микроводорослей

(Chlorella, Scenedesmus, Ankistrodesmus) тиамина, биотина, рибофлавина,

пиридоксина, никотиновой кислоты и каротина. На синтез 1 кг сухого вещества биомассы хлореллы обычно расходуется 15…18 г фосфора.

Источники калия. Калий является незаменимым элементом питания для микроводорослей. В клетках калий в большой мере определяет кол- лоидно-химические свойства цитоплазмы и функциональную активность клеток, регулируя собственные вещества клетки. Поглощение калия клетками микроводорослей является активным метаболическим процессом и связано с использованием световой энергии в автотрофных условиях. При недостатке калия у микроводорослей ингибируется фотосинтез и усиливается дыхание. Нарушается утилизация углеводов, в результате чего возрастает их содержание в клетках. Хлорелла развивается нормально в широком диапазоне концентраций калия, ингибирование роста в непрерывной интенсивной культуре наблюдается лишь при 6200 мг/л элемента (в виде KNО3) в среде. Недостаток калия проявляется агглютинацией клеток и их укрупнением, что свидетельствует о задержке деления. Наблюдаются уродливые формы деления и плазмолиз клеток. Калий часто вносится в среду в концентрациях, больших, чем требуется для водорослевой культуры, что связано с применением нитрата калия, дозируемого, как правило, по азоту, а также с использованием фосфатов калия для увеличения буферности среды и гидроокиси калия для нейтрализации питательного раствора.

Источники магния. Магний входит в состав хлорофилла и ряда других органических соединений. Магний, связанный с органическими веществами клетки, участвует во многих ферментативных процессах. Особенно существенна его роль в фотосинтезе и сопряжённых с ним реакциях. При недостатке магния в питательной среде для хлореллы за счёт снижения биосинтеза белка возрастает накопление в клетках углеводов, снижается рост культуры.

Содержание магния в питательной среде в пределах 100…240 мг/л в таких условиях обеспечивает нормальный рост хлореллы. При концентрациях магния в среде менее 10 мг/л снижается механическая прочность клеток. Вследствие этого утилизация элемента в непрерывной культуре не может быть полной, но может достигнуть 80…90%. На синтез 1 кг сухой биомассы хлореллы расходуется 4…6 г магния. Магний обычно применяют в виде сульфата, который одновременно служит источником серы, причём в этом соединении магний и сера находятся в нужных для хлореллы соотношениях.

Источники серы. Сера входит в состав белков, ферментов, пептидов, серосодержащих аминокислот, а также является компонентом многих других органических соединений клетки. Некоторые соединения серы

38

участвуют в окислительно-восстановительных реакциях, биосинтезе и метаболизме различных веществ. В частности, важна роль серы в определении свойств и структурных превращений белковой молекулы. Большинство водорослей усваивают окислённые соединения серы – сульфаты.

В процессе метаболизма в клетке сульфаты восстанавливаются до сульфгидрильного уровня. При определённых условиях в клетке может происходить процесс, обратный восстановлению сульфата, – окисление органических соединений серы до неорганического сульфата.

Физиологическая роль серы у хлореллы связана с процессами деления клеток. Сера в питательных средах для микроводорослей чаще всего применяется в виде сульфата. Определённые виды микроводорослей способны использовать в качестве источника серы и другие её соединения. Chlorella pyrenoidosa одинаково эффективно использует серу в виде сульфатов и тиосульфатов, а также серу аминокислот метионина и цистеина. Некоторые водоросли способны утилизировать восстановленные формы серы – сероводород и сульфид.

При культивировании хлореллы содержание серы в клетках составляет 4…11 г на 1 кг сухой биомассы. Сера вносится в питательную среду обычно в виде сульфатов магния и калия или аммония. При культивировании в производственных условиях практикуют использование калимагнезии.

2.4. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

Питательная среда – это субстрат, содержащий вещества-источники элементов, необходимых для поддержания обменных процессов, протекающих в клетках, в процессе их жизнедеятельности – получение и обмен энергией и построение структурных элементов клетки. Микроводоросли обладают способностью изменять химический состав клеток в зависимости от условий культивирования. Изменением состава питательной среды можно добиться изменения содержания белка в клетках от 8 до 60% и более, углеводов от 6 до 37%, жиров от 5 до 85% [3, 8].

Промышленное производство биомассы микроводорослей осуществляется в жидких питательных средах. Учитывая физиологические особенности микроводорослей, для их культивирования применяют синтетические питательные среды, в состав которых входят неорганические минеральные соли – источники азота (KNO3, сульфат аммония, мочевина), фосфора (фосфаты), калия (KNО3), серы (MgSO4, KSO4, NH3SO4) и т.д. Существуют разработки по культивированию биомассы микроводорослей на сточных водах [11].

Питательные среды для микроводорослей составляют в зависимости от целевого продукта. По этому признаку питательные среды можно раз-

39

делить на две группы. К первой группе относятся среды, богатые азотом, позволяющие получать большое количество биомассы микроводорослей, в том числе обогащённой белком. К таким средам относятся Тамийя, ТАР, А-5. Химический состав этих сред приведён в табл. 1.

Вторая группа питательных сред предназначена для культивирования микроводорослей в стрессовых условиях с целью накопления в клетках липидов. Характерной особенностью этих питательных сред является пониженное содержание источников азота. Примерами таких сред являются Майерса, Тамия со сниженным содержанием азота. Химический состав этих сред приведён в табл. 1.

1. Питательные среды для культивирования микроводорослей

40