Основы биотехнологии микроводорослей. Учебное пособие для студентов очного и заочного отделений и магистрантов направлений 19.03.01, 19.04.01 «Биотехн

6.«Осмотический шок» возникает в клетках при резком изменении осмотического давления, например, при повышении/снижении концентрации соли или сахара в окружающей среде. Оболочки клеток разрываются под давлением воды, проникающей внутрь клетки. Наибольшую эффективность осмотический шок проявляет при дезинтеграции клеток

смалопрочной и проницаемой клеточной оболочкой.

7.Автоклавирование – это нагревание среды насыщенным паром под давлением 1,1..2,0 атм в специальных аппаратах – автоклавах. При этом температура пара составляет 119..127 °С. Такое воздействие реализует принцип теплового шока. Белки клеток коагулируют и теряют свои функциональные свойства. Липиды, входящие в состав клеточной стенки, окисляются, утрачивают свою структурообразующую функцию, в результате стенка становится проницаемой.

8.Применение химических реагентов предполагает воздействие щелочей, кислот, солей, детергентов, хелатных агентов и органических растворителей. Эти реагенты, воздействуя на клеточную оболочку, вызывают денатурацию и коагуляцию белков, окисление компонентов клеточной стенки, разрушение мембранной структуры. Недостатком этого метода является воздействие реагентов на другие клеточные структуры, вызывая загрязнение или разрушение целевого продукта и стоков.

9.Ферментный лизис – это обработка суспензии клеток гидролитическими ферментами или ферментными комплексами, разрушающими связи между веществами клеточной стенки. Это очень эффективный и быстрый способ, но его применение ограничено лабораторными условиями из-за высокой стоимости ферментных препаратов. Перспективно применение иммобилизованных ферментных препаратов.

10.Действие антибиотиков в значительной мере зависит от состава клеточной оболочки. Механизм их действия различен [21].

Нарушение синтеза клеточной стенки. Антибиотики действуют на ферменты клеточной стенки транспептидазу и карбоксипептидазу, связывая их. В результате клетка теряет способность образовывать поперечные сшивки между ферментами пептидогликана, при делении клетки не происходит формирования новой клеточной стенки, и микроорганизм гибнет.

Нарушение синтеза белка. Белки собираются из аминокислот на рибосомах. Действие антибиотиков заключается в том, что их молекулы ковалентно связываются с большими субъединицами рибосом и ингибируют связывание т-РНК с инициирующим экзоном м-РНК, тем самым угнетая начальную стадию синтеза белка.

Нарушение синтеза нуклеиновых кислот. Активный центр анти-

биотиков связывается с активным центром фермента РНК-полимеразы, блокируя синтез РНК.

52

Повреждение цитоплазматической мембраны (ЦПМ). Активный центр антибиотиков взаимодействует с липидами ЦПМ, образуя в мембране поры.

Для переработки биомассы микроводорослей перспективными являются комплексные методы, включающие комбинацию механического воздействия, теплового шока и ферментативного гидролиза биомассы.

3.3. ЭКСТРАКЦИОННЫЕ МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ МЕТАБОЛИТОВ ИЗ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

Эктракционные методы используют в биотехнологии микроводорослей для получения липидов, полипептидов, пигментов и других внутриклеточных компонентов. Целевой продукт извлекается из дезинтеграта – предварительно разрушенных клеток – жидкостью (экстрагентом) из твёрдой или жидкой фазы (рафината). После перехода в экстрагент целевого продукта эта смесь называется экстракт. Твёрдую фазу после извлечения из неё растворённого вещества называют шрот [7].

В качестве экстрагентов, в зависимости от вида извлекаемого вещества, используется вода, водные растворы щелочей и кислот, органические растворители. Высокоэффективная технология извлечения липидов подразумевает использование легколетучих экстрагентов для снижения энергетических затрат при последующей отгонке [7].

Наиболее часто в технологии извлечения липидов из живых клеток и тканей используется смесь органических растворителей, один из которых полярный, а второй – неполярный [22].

При погружении клетки в органический растворитель, последний взаимодействует с клеточной оболочкой, формирует вокруг клетки статичную плёнку. Эта плёнка не разрушается в любом потоке растворителя и при перемешивании.

Нейральные липиды химически представляют собой цепочки трёх сложных эфиров высших жирных кислот и трёхатомного спирта глицерина (триглицериды) [16]. Между остатками жирных кислот возникают слабые ван-дер-ваальсовы взаимодействия, поэтому нейтральные липиды образуют пространственные структуры – глобулы, локализованные непосредственно в цитоплазме. Полярные липиды (фосфолипиды) представляют собой сложные эфиры многоатомных спиртов и высших жирных кислот, содержащие остатки фосфорной кислоты. Характерной особенностью полярных липидов является наличие в молекуле гидрофильной и гидрофобной частей. Полярные липиды в клетке формируют мембранные образования и находятся в виде липидно-белковых ассоциаций [16].

Неполярные органические растворители (гексан, петролейный эфир, бензин, хлороформ и др.) проникают через ЦПМ в цитоплазму, взаимо-

53

действуют с нейтральными липидами, образуя с ними связи, аналогичные ван-дер-ваальсовым. Полученный комплекс «органический растворитель– неполярные липиды» диффундирует через клеточную мембрану и плёнку органического растворителя, окружающую клетку, в объём растворителя.

Однако ван-дер-ваальсовых взаимодействий недостаточно для разрушения белково-липидных ассоциаций в мембранах клетки.

Полярные органические растворители (метанол, этанол, изопропанол и др.) способны образовывать с полярными липидами водородные связи, в результате чего замещаются связи в липидно-белковых ассоциациях клеточных мембран. Образовавшийся комплекс «органический раство- ритель–полярные липиды» диффундирует через клеточную оболочку и статичную плёнку в объём растворителя [22].

3.4. АППАРАТУРА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

Оборудование для культивирования микроводорослей, применяемое в настоящее время можно разделить на две группы: открытые и закрытые установки биосинтеза. К открытым установкам относятся бассейны или пруды, которые могут быть как естественного, так и искусственного происхождения (рис. 12). Обычно они представляют собой неглубокие водоёмы, хорошо прогреваемые солнцем, в которых обеспечена возможность подачи воды, питательных компонентов, а нередко, и сточных вод. Такие установки являются весьма перспективными и высокопродуктивными для промышленного культивирования микроводорослей, например, как источника технических липидов, поскольку их можно применять на землях, не пригодных для строительства, сельхозугодий, а также как элемент биологической очистки сточных вод [23, 31].

Рис. 12. Открытые системы для выращивания микроводорослей:

а– открытый пруд для культивирования Spirulina в Азии;

б– пруд для культивирования Chlorella vulgaris

54

Открытые установки просты по конструкции, дёшевы и удобны для массового культивирования микроводорослей. Но главным преимуществом открытых систем является возможность применения естественных энергетических ресурсов, что позволяет снизить себестоимость биомассы водорослей. Их стоимость в 2–3 раза ниже, чем в закрытых системах. Основным недостатком таких систем является сложность управления процессом биосинтеза и сезонность в широтах с умеренным или холодным климатом.

Для получения больших объёмов биомассы с заданными свойствами используют закрытые системы, которые называются фотобиореакторы.

Все фотобиореакторы, которые существуют в настоящее время, можно условно разделить на две группы – ёмкостные фотобиореакторы и трубчатые фотобиореакторы.

Примером ёмкостных фотобиореакторов является установка, разработанная Азовским научно-исследовательским институтом рыбного хозяйства (рис. 13) [24].

Установка состоит из ёмкости 1, оснащённой источниками дневного света 12 и системой подачи газа. Ёмкость 1 выполнена из светопрозрачного материала, герметично закрыта крышкой 4 и разделена на две секции вертикальной светоотражающей перегородкой 3, которая не касается дна и крышки ёмкости.

Рис. 13. Установка культивирования микроводорослей Азовского научно-исследовательского института рыбного хозяйства:

1 – ёмкость; 2 – кожух; 3 – перегородка; 4 – крышка; 5 – газовый клапан; 6 – штуцер для подачи газовой смеси; 7 – газопровод; 8 – баллон; 9 – манометр; 10 – водяной насос; 11 – циркуляционный штуцер;

12 – источники дневного света; 13 – таймер

55

Герметичность установки преследует две цели: снижение потерь газов в атмосферу и исключение применения пеногасителей при интенсивном барботировании газа в реакционном пространстве. Перегородка предназначена для периодического переключения световых и темновых периодов освещения суспензии микроводорослей при непрерывном культивировании. Крышка ёмкости 4 оборудована газовым клапаном 5 для сброса излишков газовоздушной смеси и штуцером 6 для подачи газа по газопроводу 7 из баллона 8. Для подвода газовоздушной смеси в торцах ёмкости установлены водяные насосы 10 с подсосом газов из пространства под крышкой. Помимо постоянного внесения смеси газов в культуральную жидкость, работа насосов 10 обеспечивает тщательное перемешивание без использования внешних источников газа.

Источники дневного света 12 размещены снаружи ёмкости, с противоположных сторон каждой секции. Их включение и выключение осуществляется посредством таймера один раз в сутки. Для концентрации света вся установка помещена в кожух 2 из светоотражающего материала. Для поддержания оптимальных условий культивирования ёмкость оснащена водонагревателем с терморегулятором.

Установка для культивирования микроводорослей ВНИИ орошаемого земледелия, представленная на рис. 14 [25], отличается от предыдущей тем, что в светоотражающем коробе 1, снабжённом равноудалёнными источниками света 5, располагаются стеклянные ёмкости 3 в гнёздах решётки 4.

5

1 2

4 3

Рис. 14. Установка для культивирования микроводорослей ВНИИ орошаемого земледелия:

1 – светоотражающийкороб; 2 – стекляннаяёмкость; 3 – нагревательноеустройство; 4 – решётка с гнёздами; 5 – источники света; 6 – трубопровод подачи газа

56

Под решёткой 4 размещается нагревательное устройство 3. Каждая ёмкость снабжена датчиками освещённости, концентрации суспензии и температуры, которые заведены на пульт управления. Подача углекислого газа осуществляется по трубопроводу 6 в каждую ёмкость, отвод газа из ёмкостей производится через индивидуальные штуцеры. По окончании цикла культивирования ёмкости через крышку удаляют, заменяя на новые.

Ещё одна ёмкостная установка для культивирования микроводорослей представлена на рис. 15 [26]. Установка представляет собой ёмкость 2, установленную на каркасе 1, в которой производится культивирование микроводорослей. Внутри ёмкости смонтированы светопрозрачные обечайки 3, внутри которых установлены лампы искусственного освещения 4, подключённые к источнику питания, с помощью которого создаётся необходимая освещённость среды. Температура культуральной жидкости регулируется с помощью терморегулятора 6, погружённого в культуральную жидкость. Изменение температуры культуральной жидкости производится с помощью вентиляторов 5, которые включаются при повышении температуры выше оптимальной и выключаются при чрезмерном снижении температуры.

Рис. 15. Установка для выращивания микроводорослей:

1 – каркас; 2 – ёмкость; 3 – светопрозрачные обечайки; 4 – лампы искусственного освещения; 5 – вентилятор; 6 – терморегулятор;

7 – корпусвентиляторов; 8 – корпусустановки

57

5 2

Рис. 16. Гибкий фотобиореактор:

1, 2 – боковые рабочие поверхности; 3 – опорные элементы; 4 – натягивающие элементы; 5 – каркас

На рисунке 16 представлена оригинальная конструкция ёмкостного реактора [27].

Рабочая ёмкость реактора ограничена двумя боковыми поверхностями 1 и 2, выполненными из эластичного прозрачного материала. Боковые кромки ёмкости соединяются, например, посредством сварки. Длину ёмкости выбирают, исходя из обеспечения производительности. Рабочая ёмкость помещена в каркас 5, снабжённый опорными элементами 3, которые могут размещаться в различных конфигурациях. У концевых участков рабочая ёмкость снабжена натягивающими элементами 4. При заполнении рабочей ёмкости культуральной жидкостью к боковым поверхностям прикладывается давление, натягивая их. Удержание ёмкости происходит за счёт опорных компонентов 3. Долив и слив культуральной жидкости, подвод газа и другое осуществляется посредством коммуникаций, которые подключаются к концевым участкам 4. Для распределения газо-воздушной смеси рабочая ёмкость может быть снабжена перфорированным шлангом по всей длине.

Сотрудниками Тамбовского технического университета предложена следующая конструкция ёмкостного фотобиореактора (рис. 17) [30].

Фотобиореактор для культивирования микроводорослей состоит из непрозрачного корпуса 1, в нижней части которого расположены змеевиковые перфорированные трубки для подачи питательной среды 2 и газовоздушной смеси 3, соединённые штуцерами 4 и 5 с трубопроводами газовоздушной смеси и питательной среды соответственно. В толщу культуральной жидкости помещены светодиодные нити 6, расположенные в прозрачных капсулах 7, вставленных в перфорированную крышку 8. Предлагаемое устройство работает следующим образом. Через змеевиковые перфорированные трубки для подачи питательной среды 2 и газовоздушной смеси 3, соединённые штуцерами 5 и 6 с соответствующими трубопроводами, осуществляется барботирование углекислого газа через слой суспензии микроводорослей9, заполняющей корпус фотобиореактора 1.

58

1

2

Рис. 18. Трубчатый фотобиореактор:

1 – панель; 2, 3 – ёмкости; 4 – порты для приборов; 5 – штуцеры; 6 – устройство механического пеногашения;

7 – каналы; 8 – магнит для очистки стенок

Наиболее известны в этой области разработки компании Valcent Products Inc. США (технология Vertigro). Система Vertigro аналогична предыдущей конструкции, но предназначена для размещения на открытых площадках. Она состоит из вертикальных биореакторов, сделанных из тонких плёночных материалов, позволяющих проникать солнечному свету (рис. 19) [23].

Фотобиореакторы корпорации GreenFuel Technologies, и компании Arizona Public Service представляют собой ряд под углом или вертикально расположенных прозрачных труб для выращивания водорослей диаметром 10…20 см. Высота биореактора 2,5 м и выше. Биореакторы ориентируются на солнце. Выхлопные газы электростанции закачиваются в биореактор, создавая циркуляцию воды и водорослей в реакторе. «Созревшие» водоросли выпадают в осадок на дно реактора. Поглощение СО2 происходит во время светового дня (рис. 20).

60