Основы биотехнологии микроводорослей. Учебное пособие для студентов очного и заочного отделений и магистрантов направлений 19.03.01, 19.04.01 «Биотехн

В начале культивирования (фаза I) некоторое время микроорганизмы как бы приспосабливаются к новой среде, их концентрация не меняется. Этот период называется лаг-фаза (II). Далее начинается рост – это фаза ускорения роста (III). Третья фаза – фаза наиболее интенсивного роста, происходит наибольший относительный прирост биомассы. Это фаза экспоненциального роста (IV). Затем скорость роста (относительная) начинает уменьшаться – это фаза замедления роста (V). Достигнув некоторой максимальной величины, концентрация биомассы далее перестаёт возрастать. В этой фазе – стационарной – в среде истощаются питательные вещества и накапливаются продукты обмена, тормозящие рост. Биомасса растёт и одновременно происходит гибель части клеток (автолиз), так что общая концентрация сохраняется постоянной. И наконец, в фазе отмирания автолиз начинает преобладать над ростом, и концентрация биомассы микроорганизмов снижается.

Процесс периодического культивирования характеризуется следующими кинетическими показателями:

−кинетические показатели роста биомассы (общая и удельная скорости роста);

−кинетические показатели потребления субстрата (общая и удельная скорости потребления субстрата);

−кинетические показатели биосинтеза продуктов метаболизма общая и удельная скорость биосинтеза продукта).

Важным показателем роста биомассы при периодическом культивировании является скорость роста биомассы. Для описания скорости роста используется такая характеристика, как общая скорость роста или про-

дуктивность по биомассе Qx (г/л ч):

QX = dXdt .

Этот показатель не вполне отражает физиологическое состояние биомассы в процессе его роста, поскольку в зависимости от концентрации биомассы в среде при одинаковом абсолютном приросте относительный прирост биомассы может отличаться в разы. В связи с этим больший интерес для характеристики интенсивности роста представляет не величина QX,

аудельная скорость роста в пересчёте на единицу биомассы µ, ч–1:

μ= QXX = XdtdX .

Вэкспоненциальной фазе, когда рост ничем не лимитирован, величина µ постоянна, а рост биомассы описывается уравнением

dXdt =μX .

21

По аналогии со скоростью роста биомассы можно ввести кинетическую характеристику– общуюскоростьпотреблениясубстратаQS (г/лч):

QS = − dSdt .

Знак «минус» обозначает, что скорость потребления положительна, когда концентрация субстрата в среде падает.

Аналогично определяется удельная скорость потребления субстрата, (г/г ч):

qS = QXS = − X1 dSdt .

В некоторых процессах наряду с ростом биомассы происходит накопление в среде продукта метаболизма (его текущая концентрация Р).

Общая скорость биосинтеза продукта метаболизма QP в периоди-

ческом процессе, (г/г ч):

QP = dPdt .

Удельная скорость биосинтеза продукта из единицы биомассы обозначается qP равна

qP = QXp = X1 dPdt .

Наряду с кинетическими характеристиками, при математическом описании процессов ферментации часто пользуются и так называемыми макростехиометрическими характеристиками, которые выражают взаимосвязь между приростом биомассы, продукта и расходованием субстрата.

Простейшей такой характеристикой процесса ферментации является

выход биомассы по субстрату, или экономический коэффициент. Его определяют, сравнивая количество выросшей за весь цикл ферментации биомассы ХK к количеству загруженного субстрата S0

Выход продукта метаболизма по субстрату может быть вычислен аналогично:

22

1.4.ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

ВДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЧЕЛОВЕКА

Микроводоросли – самые быстрорастущие и высокоэнергетические растения. В настоящее время их применение чрезвычайно широко и разнообразно [3, 8 – 10].

1.Пища для человека. Во многих странах, особенно на Востоке, люди используют в пищу несколько видов водорослей, в том числе, микроводоросли. В Японии, например, сухая хлорелла применяется при изготовлении кисломолочного напитка «Yakult», хлеба, кондитерских изделий. Сухой порошок хлореллы и сценедесмуса применяют в качестве биологически активной добавки к пище [9].

2.Пища для водных животных. Водоросли лежат в основе пищевой пирамиды, поскольку синтезируют органические вещества из неорганических. Водные животные потребляют эту органику непосредственно или косвенно по пищевой цепи. Применение биомассы протококковых водорослей в качестве корма для рыбы при её промышленном производстве имеет большое значение для прудового рыбоводства. Некоторые виды рыб, например, толстолобик, питаются преимущественно водорослями. Кроме того, внесение микроводорослей в рыбоводные пруды способствует увеличению количества кормовых водных организмов, улучшает гидрохимическое состояние прудов, способствует насыщению кисло-

родом, что приводит к увеличению продуктивности рыбных прудов до 25…35% [3].

3.Удобрение. Водоросли – ценное удобрение. Содержание почвенных микроводорослей во многом определяет плодородие участка. Микроводоросли обогащают почву органическими веществами, улучшают её структуру, стимулируют рост полезных почвенных микроорганизмов. Они являются источником физиологически активных веществ, играющих важную роль в почвенных процессах, влияют на рН почвенной среды, нейтрализуя её. Под влиянием водорослей водоудерживающая способность почв повышается на 40% и более. Водоросли обогащают почву макро- и микроэлементами, продуцируют антибиотически активные вещества, способствующие самоочищению почв, благоприятно влияют на рост и развитие растений и санитарно-эпидемиологическую обстановку. В почвах содержится много видов азотфиксирующих микроорганизмов, обогащающих почву азотом. Альголизация почв протококковыми микроводорослями может проводиться несколькими способами: замочкой семян в суспензии микроводорослей, внесением микроводорослей при орошении, внесением биомассы микроводорослей под зиму [3].

4.Кормовая добавка к пище сельскохозяйственных животных.

Микроводоросли способны за короткий срок накапливать большое количество белка, липидов, витаминов, поэтому их биомасса по питательности

23

приравнивается к кормам животного происхождения. Биомасса протококковых микроводорослей давно и успешно применяется в качестве добавки к пище различных сельскохозяйственных животных в сушёном виде, в виде паст и суспензий (свиноводство, овцеводство, кролиководство, разведение крупного рогатого скота и птицы). Такая кормовая добавка позволяет у различных видов животных увеличить привес живой массы, сократить падёж, увеличить перевариваемость грубых кормов, повысить удои и яйценоскость. Существуют примеры применения протококковых микроводорослей для подкормки тутового шелкопряда и пчёл. Из-за высокой биологической активности биомассы микроводорослей насекомые охотно потребляют водорослевый прикорм, особенно в весенне-зимний период, как следствие, повышается их жизнестойкость и продуктивность. Хороший результат обеспечивает введение биомассы протококковых микроводорослей в качестве кормовой добавки в рацион американской норки. Такая подкормка значительно повышает белковый обмен, стимулирует рост и развитие, повышает качество и размер шкурок [3].

5.Диатомит. Диатомит применяется в составе абразивных порошков и фильтров, а также служит теплоизоляционным материалом, заменяющим асбест.

6.Водорослевые культуры. Биологи уже давно выращивают водоросли в лабораториях. Сначала их выращивали в маленьких прозрачных чашках с прудовой водой на солнечном свету, а в последнее время применяют для этого особые культуральные среды с определённым количеством минеральных солей и специальных ростовых веществ, а также регулируемые источники искусственного света. Обнаружено, что для оптимального развития некоторых водорослей необходимы весьма специфические условия [3].

7.Применение микроводорослей в качестве сырья для биоэнер-

гетики. В последнее десятилетие наблюдается снижение разведанных запасов высококачественной «лёгкой» нефти, истощение старых месторождений, а освоение новых сопряжено с возрастающими трудностями. Проблема усугубляется необходимостью снижения выброса парниковых газов в атмосферу. В качестве важнейшего компонента возобновляемых источников энергии рассматривают растительную биомассу. Использование биомассы микроводорослей связывают с появлением биотоплива «третьего» поколения. Считается, что биомасса микроводорослей как энергетическое сырьё по своим характеристикам превосходит другие сырьевые биоресурсы благодаря высокой продуктивности, большой скорости роста, нетребовательности к питательной среде и условиям культивирования [10, 11].

8.Комплексная технология переработки биомассы микроводо-

рослей. Химический состав биомассы никоторых видов микроводорослей может широко варьироваться в зависимости от условий культивирования.

24

Как и высшие растения, микроводоросли содержат нейтральные и полярные липиды. Нейтральные липиды состоят в основном из сложных эфиров глицерина. При благоприятных условиях микроводоросли производят в основном полярные липиды (например, фосфолипиды) [12]. Полярные липиды являются структурными компонентами всех живых клеток, входят в состав цитоплазматической, митохондриальной и других мембран, играют существенную роль в мембранной проницаемости, ответственны за расположение ферментов дыхательной цепи и перенос электронов. Поэтому фосфолипиды широко применяются в качестве пищевых добавок [10].

При неблагоприятных или ограниченных условиях роста микроводорослей (стрессовые условия культивирования) накапливаются нейтральные липиды в виде липидных капель в цитоплазме [13] и являются основными запасными компонентами клетки. Неполярные липиды находят широкое применение при производстве биотоплива, биополимеров и других продуктов технической биотехнологии.

Изменяя условия культивирования, можно получить биомассу микроводорослей с различным химическим составом. После извлечения из клеток целевых компонентов, остатки биомассы всё ещё будут содержать большое количество ценных биологически активных веществ. Анализируя все вышеперечисленные направления использования микроводорослей, можно сделать вывод о целесообразности разработки комплексной технологии переработки биомассы микроводорослей.

На рисунке 4 представлена схема комплексной переработки биомас-

сы микроводоросли Chlorella vulgaris.

1. Биомасса Chlorella vulgaris

Рис. 4. Комплексное использование биомассы микроводорослей Chlorella vulgaris

25

Технология комплексного использования биомассы микроводоросли Chlorella vulgaris заключается в следующем [10]. Штамм культивируется в течение 8 дней на стандартной питательной среде до достижения стационарной стадии роста, затем для клеток штамма создаются стрессовые условия путём пересадки на питательную среду с дефицитом азота для стимулирования накопления внутриклеточных липидов (выращивание

втечение 3 дней). Затем клетки биомассы (1) отделяются от суспензии. На следующем этапе стенки клеток разрушаются для более полного извлечения липидов. Извлечение липидов осуществляется смесью полярного и неполярного растворителей, при этом фосфолипиды (4) будут содержаться во фракции полярного растворителя, а триглицериды (3) – неполярного.

Триглицериды после проведения реакции с метанолом (метанолиз)

вприсутствии катализатора образуют метиловые эфиры жирных кислот (компонент смесевого биодизельного топлива) и технический глицерин, который применятся во многих отраслях промышленности (производство моющих и косметических средств, сельское хозяйство, текстильная, бумажная и кожевенная отрасли промышленности, производство пластмасс, лакокрасочная промышленность, электротехника и радиотехника).

Извлечённые фосфолипиды подвергаются очистке и используются

вкачестве пищевой или биологически активной добавки к пище [14].

Остатки биомассы (5) (белки, углеводы) подвергаются очистке и используются как добавка для корма сельскохозяйственных животных, либо смешиваются с отходами сельского хозяйства и используются для получения биогаза, жидких и твёрдых удобрений.

26

2. ОСНОВЫ БИОХИМИИ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

2.1. ФОТОСИНТЕЗ

Фотосинтез – это процесс, при котором происходит поглощение электромагнитной энергии Солнца фотосинтетическим аппаратом растений – хлорофиллом и вспомогательными пигментами, и восстановление за счёт неё атмосферного углекислого газа в сложные органические соединения [5]. Процесс фотосинтеза можно описать следующим суммарным уравнением:

6CO2 +6H2O свет, хлорофилл→C6H12O6 +6O2 .

Процесс фотосинтеза представляет собой цепь окислительновосстановительных реакций, где происходит восстановление углекислого газа до органических веществ. Всю совокупность фотосинтетических реакций принято подразделять на две фазы – световую и темновую.

Световая фаза фотосинтеза. Прохождение световой фазы связано с мембранами тилакоидов при участии хлорофилла и других пигментов, фермента АТФ-синтетазы, встроенного в мембрану тилакоидов, и белковпереносчиков.

Для световой фазы фотосинтеза характерно то, что энергия солнечной радиации, поглощённая хлорофиллами, преобразуется сначала в электрохимическую, а затем в энергию макроэргических связей АТФ. Это достигается путём переноса электронов и ионов водорода с помощью специальных переносчиков через мембрану тилакоидов (рис. 5).

Световая фаза фотосинтеза разделяется на фотофизическую и фотохимическую. В фотофизической фазе происходит поглощение квантов света молекулами хлорофиллов П700 (фотосистема I) и П680 (фотосистема II) и переход этих молекул в возбуждённое состояние.

В фотохимической фазе обе фотосистемы работают согласованно. Фотосистема I. Возбуждённая молекула П700 отдаёт электрон

акцептору. От него по системе переносчиков этот электрон попадает на внешнюю сторону тилакоида (обращённую в строму). При этом моле-

кула П700 окисляется и П700 превращается в П700+ :

хлорофилл П700 свет→хлорофилл П700+ +е− .

Фотосистема II. Возбуждённая молекула П680 отдаёт электрон акцептору. От него по системе переносчиков электрон переходит в фотосистему I и восстанавливает молекулу П700. При этом молекула П700 возвращается в исходное состояние и становится вновь способной поглощать свет и переходить в возбуждённое состояние.

27

мембранатилакоида

Рис. 5. Схема фотосинтеза (стрелками показан перенос протонов и электронов)

Молекула же П680, отдав электрон, превращается в П680+ . Для её вос-

становления используются электроны, отщепляемые от молекул воды в процессе так называемого фотолиза, или фотоокисления:

2H2O −4e− → 4H+ +O2 .

Благодаря фотолизу внутри тилакоида накапливаются протоны и образуется молекулярный кислород, который диффундирует в атмосферу. Кислород является побочным продуктом реакций фотосинтеза.

Протоны, образовавшиеся при фотолизе, не могут проникнуть через мембрану тилакоида и накапливаются внутри, создавая Н+-резервуар. Таким образом, по разные стороны мембраны накапливаются протоны и электроны, т.е. возникает электрохимический мембранный потенциал. Когда он достигает величины 200 мВ, протоны проталкиваются силой электрического поля через каналы фермента АТФ-синтетазы, встроенного в мембрану тилакоидов, т.е. начинает работать протонная помпа. На выходе из протонного канала создаётся высокий уровень энергии, которая используется для фосфорилирования имеющихся в матриксе хлоропластов молекул АДФ:

АДФ+H3PO4 E→АТФ+H2O .

28

Перенесённые протоны взаимодействуют с электронами и молекулой НАДФ (кофермент никотинамидадениндинуклеотидфосфат), образуя комплекс НАДФ·Н + Н+:

НАДФ+ +2e− +2H+ → НАДФ H +H+ .

Таким образом, активированные световой энергией электроны используются для присоединения атома водорода к его переносчику, т.е. на восстановление НАДФ+ в НАДФ·Н + Н+.

В конечном итоге, в световой фазе фотосинтеза образуются АТФ, НАДФ-восстановленный кофермент и кислород, являющийся побочным продуктом фотосинтеза. Полученные АТФ и НАДФ-восстановленный кофермент используются в темновой фазе фотосинтеза.

Темновая фаза фотосинтеза происходит параллельно световой фазе. Этот сложный процесс, осуществляемый в строме хлоропластов без непосредственного поглощения света, включает большое количество реакций, приводящих к восстановлению СO2 до уровня органических веществ, за счёт использования энергии АТФ и НАДФ·Н+Н+, синтезированных в световую фазу. Существуют разные пути восстановления. Основным из них является так называемый С3-путь, или цикл Кальвина

(рис. 6).

Конденсации и перестройки

С3-, С4-, С5-, С6- и С7-

Конечный продукт С6-Ф Гексозомонофосфат

сахарофосфатов

Крахмал и сахароза

Рис. 6. Цикл Кальвина

29

Восстановительный пентозофосфатный цикл или цикл Кальвина – серия биохимических реакций, осуществляемая при фотосинтезе организмами фото- и хемосинтетиками (растения, водоросли, пурпурные, цианобактерии и др.), является наиболее распространённым (но не единственным) из механизмов автотрофной ассимиляции углекислого газа. За открытие химизма усвоения растениями углекислого газа в процессе фотосинтеза американский биохимик Мелвин Эллис Кальвин был удостоен Нобелевской премии.

Цикл Кальвина состоит из трёх стадий:

1.Карбоксилирование. К рибулозо-1,5-бифосфату присоединяется

CO2 под действием фермента рибулозобисфосфат-карбоксилаза/оксигеназа. Этот белок составляет основную фракцию белков хлоропласта и, предположительно, наиболее распространённый фермент в природе. В результате образуется промежуточное неустойчивое соединение, распадающееся на две молекулы 3-фосфоглицериновой кислоты (ФГК).

2.Восстановление ФГК. Сначала она фосфорилируется АТФ под действием фосфороглицерокиназы с образованием 1,3-дифосфоглицериновой кислоты (ДФГК), затем при воздействии триозофосфатдегидрогеназы и НАДФ·Н ацилфосфатная группа ДФГК дефосфорилируется и восстанавливается до альдегидной и образуется глицеральдегид-3-фосфат – фосфорилированный углевод (ФГА).

3.Регенерация акцептора CO2. На этой стадии участвуют 5 молекул ФГА, которые через образование 4-, 5-, 6- и 7-углеродных соединений объединяются в 3-, 5-углеродных рибулозо-1,5-бифосфата, для чего необходимы 3АТФ.

Для синтеза одной молекулы глюкозы необходимо две молекулы ФГА, 6 молекул CO2, 12 молекул НАДФ·Н+Н+ и 18 молекул АТФ и 6 оборотов цикла Кальвина.

В темновой фазе фотосинтеза, таким образом, энергия макроэргических связей АТФ преобразуется в химическую энергию органических веществ, т.е. энергия как бы консервируется в химических связях органических веществ.

На скорость фотосинтеза оказывают влияние различные факторы окружающей среды: интенсивность падающего света, наличие влаги,

минеральных веществ, температура, концентрация СО2 и др. Уникальность и общебиологическое значение фотосинтеза опреде-

ляются тем, что ему обязано своим существованием всё живое на нашей планете. Этот процесс является основным источником образования первичных органических веществ, а также единственным источником свободного кислорода на Земле. Из кислорода образовался и поддерживается озоновый слой, защищающий живые организмы от воздействия коротковолновой ультрафиолетовой радиации. Кроме того, благодаря фотосинтезу регулируется содержание СО2 в атмосфере.

30