Основы биотехнологии микроводорослей. Учебное пособие для студентов очного и заочного отделений и магистрантов направлений 19.03.01, 19.04.01 «Биотехн
.pdf
Рис. 19. Фотобиореактор Vertigro
Рис. 20. Фотобиореакторы корпорации GreenFuel Technologies
Фотобиореакторы фирм BioKing и AEN Engineering GmbH&Co пред-
ставляют собой систему прозрачных горизонтально расположенных пластиковых труб, по которым принудительно циркулирует культуральная жидкость, содержащая микроводросли. В эту жидкость подаётся углекислый газ и различные добавки, необходимые для роста культуры и убирается выделяющийся в процессе жизнедеятельности кислород (рис. 21) [23].
61
Рис. 21. Фотобиореакторы фирм BioKing и AEN Engineering GmbH&Co
Фотобиореакторы и другие виды закрытых систем не позволяют получать большие объёмы биомассы, либо требуют применения сложных технических устройств и средств управления, что удорожает себестоимость производимой продукции. Сами конструкции закрытых фотобиореакционных установок сложны и дорогостоящи, что препятствует их широкому распространению.
62
4. МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТОВ ИЗ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ
4.1. МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ
В связи с тем, что экспериментальное исследование процесса культивирования микроводорослей является затратным процессом как с точки зрения ресурсов, так и времени, актуальной задачей является разработка математической модели, способной описывать процессы накопления биомассы клеток микроводорослей, убыли субстрата и накопления липидов.
Процесс культивирования микроводоросли может быть представлен в виде следующей схемы (рис. 22).
Протекание стадии интенсивного культивирования биомассы определяется входными параметрами T, S, I, изменение которых влияет на количество накопленных липидов X, и внутренними KS, Ki, KI, μmax, E, которые зависят от физических свойств среды, вещества и т.д.
При разработке математической модели кинетики роста биомассы микроводоросли и накопления липидов внутри клетки приняты следующие допущения:
Д1. Процесс культивирования биомассы хлореллы состоит из двух периодов: накопления биомассы клеток, в течение которого не происходит образования и накопления липидов; создания стрессовых условий при которых происходит образование и накопление липидов.
Д2. Гидродинамический режим в рабочем объёме фотобиореактора близок к идеальному перемешиванию, поскольку процесс культивирования осуществляется периодическим способом, при интенсивной аэрации газовоздушной смесью. Подвод пузырьков газовоздушной смеси к клетке не затруднён.
Д3. Кислород равномерно распределён по рабочему объёму фотобиореактора и его количества достаточно для осуществления клетками энергетического обмена.
T |
Стадия интенсивного |
X |
|
S |
культивирования биомассы |
||
I |
|
||
|
|
KS, Ki, KI, µmax, E
Рис. 22. Структурная схема процесса культивирования биомассы:
Т – температура; S – вектор концентраций субстратных компонентов;
I – интенсивность инсоляции; X – концентрация биомассы микроводорослей; K, µ, Е – кинетические коэффициенты процесса биосинтеза
63
Д4. Освещение в рабочем объёме фотобиореактора осуществляется равномерно.
Д5. Возраст клеток не учитывается при моделировании процесса образования липидов.
Д6. Основным лимитирующим субстратом являются азотосодержащие соли.
Д7. При создании стрессовых условий в питательной среде поддерживается низкая концентрация азотосодержащих солей.
Д8. Процесс культивирования осуществляется в интервале значений pH, оптимальных для накопления биомассы.
Д9. Процессы питания, фотосинтеза, размножения и другие идут одновременно.
Д10. Влияние на скорость роста освещения и концентрации азотосодержащих солей независимо.
Математическая модель кинетики культивирования биомассы микроводоросли Chlorella vulgaris включает в себя следующие уравнения.
1. Проведённые экспериментальные исследования процесса накопления биомассы микроводорослей (рис. 23) показали, что характер кривой соответствует логистическому уравнению Ферхюльста для ограниченного роста популяции [33]:
dX |
|
|
X |
|
|
dt |
=μX 1 |
− |
|
, |
(1) |
|
|||||
|
|
K |
|
||
где X – концентрация биомассы клеток, млн. кл./мл.; μ– удельная скорость роста, 1/сут; K – ёмкость популяции, млн. кл./мл.
кл/мл |
40 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
млн. |
30 |
|
|
|
|
клеток, |
20 |
|
|
|
|
количествоx, |
|
|
|
|
|
10 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
00 |
5 |
10 |
15 |
20 |
|
|
t,время культивирования, сутки |
|
||
Рис. 23. Кинетика роста биомассы микроводорослей
64
2. Процесс убыли субстрата при периодическом культивировании микроводорослей описывается уравнением [34]
dS = − |
1 |
dX + |
1 |
dP + m X , |
(2) |
||
|
|
||||||
dt |
|
YXS |
dt |
YPS |
dt |
s |
|
|
|
|
|||||
где YXS – коэффициент, |
показывающий количество образующейся био- |
||||||
массы X при количестве затраченного субстрата S за время |
t, рассчи- |
||||||
тывается по экспериментальным данным (млн. кл·л)/(мл·г); YPS – коэф-
фициент, показывающий количество образующихся липидов P при количестве затраченного субстрата S за время t, рассчитывается по экспериментальным данным; P – количество липидов, %; ms – коэф-
фициент поддержания жизнедеятельности.
В соответствии с допущением Д7 расходование азотсодержащего субстрата не происходит при накоплении продуктов метаболизма, поэтому второе слагаемое исключаем из уравнения (2). Для неэнергетических субстратов, таких как азот, ms = 0 [34]. Таким образом, уравнение (2) пре-
образуется к виду (3)
dS |
= − |
1 |
dX . |
(3) |
|
dt |
Y |
||||
|
dt |
|
|||
|
|
XS |
|
|
3. Количество образующихся липидов P пропорционально величине накопленной биомассы X микроводорослей. Для образования липидов необходимо создание стрессовых условий – пониженного содержания субстрата S – азотсодержащей соли, т.е. количество P должно быть про-
порционально 1/ S r , где r – показатель степени. Концентрация биомассы микроводорослей X достигает максимального значения K, после чего дальнейший прирост прекращается. Можно предположить, что аналогичным образом будет прекращаться рост количества образующихся липидов. Максимально возможное количество липидов будет определяться тогда величиной Pmax. С учётом вышесказанного уравнение для расчёта количества образующихся липидов может быть записано в виде
dP |
|
qP |
|
|
P |
|
|
|
= |
|
X 1 |
− |
|
, |
(4) |
dt |
S r |
|
|||||
|
|
|
Pmax |
|
|||
где qP – величина, характеризующая максимальный прирост липидов
в единицу времени, 1/сут; Pmax – максимальное количество накопленных липидов, %.
С целью определения коэффициентов, входящих в уравнения (1), (3), (4), был проведён комплекс экспериментальных исследований.
65
Величина максимальной ёмкости популяции K = 31 млн. кл./мл определялась из графика, представленного на рис. 23 и соответствовала максимальной достигнутой концентрации клеток биомассы.
Известно [7, 32 – 34], что факторами, оказывающими наиболее сильное влияние на величину удельной скорости роста μ, являются: темпера-
тура T, уровень освещённости I, концентрация азотсодержащих солей S, т.е.
μ = μ(T , I, S). |
(5) |
Влияние каждого из факторов рассматривалось при фиксированных и оптимальных значениях других факторов.
Были проведены экспериментальные исследования по культивированию микроводоросли Сhlorella vulgaris в питательных средах при различных значениях концентраций нитрата калия (рис. 24).
Анализ графика, приведённого на рис. 24 позволяет сделать вывод, что процесс ингибирования роста биомассы повышенными концентрациями субстрата S описывается уравнением Эндрюса [4]
|
|
|
|
S |
|
|
|
|
|
μ(S) |
I =const |
= μ |
|
|
|
|
, |
(6) |
|
|
2 |
|
|||||||
|
|
max |
Ks + S + S |
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
/ King |
|
|
||
где μmax = 1,1 1/сут – максимальная удельная скорость роста микроорганизмов; S – количество субстрата (азотсодержащие соли), г/л; Ks = 1,06 г/л –
константа полунасыщения; King = 8,4 |
– константа ингибирования, г/л, |
I = const = 5600 лк. Величины μmax , |
Ks , King определены по графику |
на рис. 24. |
|
Рис. 24. Зависимость удельной скорости роста μ от количества субстрата S
66
Рис. 25. Зависимость удельной скорости роста μ от освещённости I
Влияние уровня освещённости I на кинетику прироста микроводорослей наиболее часто описывается уравнением Михаэлиса–Ментен [35]
|
I |
|
|
|
μ(I)S =const =μmax |
, |
(7) |
||
|
||||
|
KI + I |
|
||
где KI = 15 000 лк – константа полунасыщения по освещённости, определена по результатам обработки экспериментальных данных при концентрации азотосодержащих солей S = 5 г/л (рис. 25).
В процессе культивирования микроводоросли, от температуры T зависит максимальная удельная скорость роста μmax , входящая в форму-
лы для расчёта μ(S)I =const , μ(I )S =const . Величины Ks и King в меньшей степени зависят от температуры T [34], поэтому уравнение для расчёта максимальной удельной скорости роста μmax было записано в виде степенной зависимости от температуры T
μ |
max |
(T ) = A + A T + A T 2 |
, |
(8) |
|
|
0 1 |
2 |
|
|
|
где A0 = −1,3 103 ; A1 = 8,6 ; A2 = −0,01 – коэффициенты, найденные путём
решения системы, состоящей из трёх уравнений (9) для температур 300, 303, 308 К.
В соответствии с допущением Д10 принимаем зависимость [34]
μ = 0,5(μ(S)I =const +μ(I )S =const ). |
(9) |
Величина YXS находится как среднее значение, полученное в результате обработки экспериментальных кривых накопления биомассы микроводорослей X(t) и количества субстрата S(t), по формуле [7]
YXS = Xn − X0 , (10)
S0 − Sn
где 0, n – первый и последний дни эксперимента
YXS = 6,05 (млн. кл л)/(мл г).
67
|
|
Величина удельной скорости биосинтеза продуктов qp |
рассчитыва- |
|||||
лась по аналогии с формулой для расчёта удельной скорости роста клеток |
||||||||
[7] по формуле |
|
qp = ln Pn −ln Pn−1 . |
|
|
||||
|
|
|
|
|
(11) |
|||
|
|
|
|
|
Sn − Sn−1 |
|
|
|
|
|
Величины qp = 1,5; Pmax = 32% и r = 2 были определены в результате |
||||||
обработки экспериментальных данных по кинетике накопления липидов. |
||||||||
|
|
Решение системы обыкновенных дифференциальных уравнений (1), |
||||||
(3), (4), (5) осуществлялось методом Рунге-Кутта 4 порядка [35] в среде |
||||||||
Matlab [36]. Начальные условия при t = 0: |
|
|
|
|||||
|
|
|
|
X(0) = 2, |
S(0) = 5, |
P(0) = 4. |
|
(12) |
|
|
Результаты решения представлены на рис. 26 – 28. |
|
|
||||
клеток, млн.кл/мл |
40 |
Модель |
|
|
5 |
|
|
Модель |
|
|
|
|
|
||||
|
Эксперимент |
|
|
|
|
|
Эксперимент |
|
30 |
|
|
|
4 |
|
|
|
|
20 |
|
|
|
3 |
|
|
|
|
|
|
|
калиянитраталг/, |
|
|
|
||
x,концентрация |
|
|
|
|
2 |
|
|
|
10 |
|
|
|
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
0 |
5 |
10 |
15 |
S,концентрация 00 |
5 |
10 |
15 |
|
|
0 |
20 |
t,время культивирования, сутки |
|||||
|
|
t,время культивирования, сутки |
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|||
Рис. 26. Количество клеток |
|
Рис. 27. Количество |
||
биомассы, млн. кл./мл |
|
субстрата, г/л |
||
|
40 |
Модель |
|
|
,% |
|
|
|
|
|
Эксперимент |
|
|
|
липидов |
|
|
|
|
30 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
P,концентрация |
20 |
|
|
|
10 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
00 |
5 |
10 |
15 |
|
|
t,время культивирования, сутки |
||
Рис. 28. Количество липидов, % масс.
68
Анализ полученных результатов позволяет сделать заключение, что максимальная величина прироста биомассы микроводорослей и накопления внутриклеточных липидов обеспечивается в период до 15 суток, после чего стадию биосинтеза целесообразно прекратить.
4.2.МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССА РАЗРУШЕНИЯ КЛЕТОК
Разрушение клеток обычно описывают кинетической моделью первого порядка, как, например, описывал Хезерингтон и другие [37] для дрожжевой клетки, разрушенной для извлечения белков. Похожая кинетическая модель первого порядка используется для описания разрушения клеток микроводорослей с помощью ультразвука или гомогенизации высоким давлением (ГВД):
dCd |
= K(C0 −Cd ) , |
(13) |
|
dt |
|||
|
|
где Cd – число клеток, которые были разрушены в единице объёма за время t (клеток/мм3); С0 – количество неповреждённых клеток, первоначально присутствующих в культуре на единицу объёма или начальная концентрация клеток культуры (клеток/мм3); t – длительность разрушения в эксперименте; K – константа скорости разрушения. При ультразвуковом разрушении t является временем действия ультразвука (с); K – константой скорости разрушения ультразвуком (1/с). Для ГВД, t – количество проходов через ГВД-клапан, K – константа скорости разрушения ГВД (1/проход).
Начальное условие может быть записано в виде
Cd (0) = 0. |
(14) |
Решая уравнение (13) с начальным условием (14), получим |
|
Cd =C0 (1−e−Kt ). |
(15) |
Далее осуществляется переход к безразмерным переменным |
|
Cd =C0 −C, |
(16) |
где С – количество интактных (целых) клеток, присутствующих в культуре на единицу объёма в момент времени t (клеток/мм3).
Подставляя (16) в (15), получаем
C0 −C =C0 (1−e−Kt ). |
(17) |
В безразмерных переменных уравнение (17) можно записать в виде
|
|
|
|
D = (1−e−Kθ), |
(18) |
где D = |
C0 −C , θ = |
|
t |
. |
|
t |
|
|
|||
|
C |
max |
|
||
|
0 |
|
|
||
В уравнении (18) D – безразмерная концентрация клеток микроводо- |
|||||
рослей |
культуры; K – безразмерная постоянная |
скорости разрушения; |
|||
69
θ – безразмерное время; tmax – максимальная продолжительность эксперимента, при которой проводилось разрушение (25 мин для обработки ультразвуком, 5 проходов для ГВД).
Величина D характеризует часть неповреждённых клеток культуры, которая была подвергнута процессу разрушения в течение времени t и может быть понята как степень разрыва. Безразмерная постоянная скорости разрушения K характеризует эффективность процесса разрушения клеток микроводорослей. Более высокое значение K указывает на более быстрое разрушение клеток.
4.3. МАТЕМАТИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ ПРОЦЕССА ЭКСТРАКЦИИ
Процесс экстракции из растительного материала поясняется рис. 29
[22].Процесс экстракции может быть разбит на несколько этапов.
Этап 1. Смесь неполярного и полярного органических растворителей
проникает через клеточную мембрану в цитоплазму.
Этап 2. Смесь взаимодействует с липидным комплексом. Во время этого взаимодействия неполярный органический растворитель окружает липидный комплекс и образует ван-дер-ваальсово взаимодействие с нейтральными липидами в комплексе, в то время как полярный органический растворитель также окружает липидный комплекс и образует водородные связи с полярными липидами в комплексе. Водородные связи достаточно сильны, чтобы заместить связывание липидов в липид-белковых ассоциациях клеточной мембраной.
Рис. 29. Схема процесса экстракции липидов из клетки
70