Основы биотехнологии микроводорослей. Учебное пособие для студентов очного и заочного отделений и магистрантов направлений 19.03.01, 19.04.01 «Биотехн

41

42

43

2.5. СТЕХИОМЕТРИЯ ПРОЦЕССА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

Основной целью расчёта стехиометрических соотношений в биотехнологии является определение прироста биомассы или продукта на заданное количество субстрата [7]. Иногда применяется и обратный пересчёт.

Стехиометрическое уравнение для любых микробиологических процессов можно записать так [7]:

kC (углеродныйсубстрат)+ kN (азотный субстрат)+ + kP (фосфорныйсубстрат)+ kO2 (кислород)+... = = kX (биомасса)+ kP (продуктыметаболизма)+

+ kCO2 (CO2 )+... + kH2O (H2O)+ k H H ,

где k – стехиометрические коэффициенты.

При этом в биологии, как и в химии, действует закон сохранения материи: атомы органогенных элементов (кислорода, азота, углерода, водорода, фосфора, серы и т.д.) перегруппировываются, но общее количество элементов, входящих в структуры клетки, остаётся равным количеству, которое клетка получила из питательной среды. Биомасса состоит из множества различных веществ – белков, нуклеиновых кислот, липидов и т.д., состав и соотношение которых нельзя указать определённо. Поэтому при расчётах стехиометрических коэффициентов пользуются условной «формулой» биомассы, полученной эмпирически. «Формула» биомассы показывает массу соответствующего элемента, содержащегося в биомассе, отнесённую к атомной массе этого элемента. Коэффициенты в «формуле» биомассы, как правило, дробные, и приводятся к одному атому углерода (так называемый C-моль). Как правило, в расчётах используется усреднённая формула биомассы, предложенная Стоутхамером для C-моля – CH1,8O0,5N0,2 и обобщённая формула субстрата

CmHnOpNq.

Энергетический выход биомассы – отношение энергии, заключён-

ной в субстрате, к энергии, заключённой в биомассе:

где γS, γX – степень восстановленности соответственно субстрата и биомассы, равная сумме числа электронов в атомах веществ (эквивалент химической валентности).

Поскольку энергетический выход является величиной безразмерной, от него можно перейти к массовому выходу:

44

YXS = η M X ,

M S

где MX, MS – молеклярные массы C-молей биомассы и субстрата соответственно.

Пример. Рассчитать количества потребляемого углекислого газа и выделяемого кислорода при культивировании фотосинтетических организмов (микроводорослей) в стрессовых условиях с целью накопления неполярных липидов.

1. Около 65% всех жирных кислот хлореллы приходится на ненасыщенные кислоты [39, 40]. Так как доля ненасыщенных кислот в жирнокислотном составе хлореллы велика, а соотношение атомов, входящих в состав кислот, мало отличается, рассчитаем усреднённую формулу липидов хлореллы с учётом остатка глицерина. Индексы атомов у усреднённой формулы жирных кислот найдём как среднеарифметическое значение индексов атомов данных кислот (пальмитиновая C15H31COOH, миристиновая C13H27COOH, олеиновая С17H33COOH, лауриновая C11H23COOH):

Таким образом, усреднённая формула жирных кислот: С15Н30О2. Усреднённую формулу липидов составим из остатка усреднённой

формулы кислот и остатка глицерина, что можно условно описать уравнением

С3Н5(ОН)3 + 3С14Н29СООН = С3Н5(ОСОС14Н29)3 + 3Н2О.

Таким образом, усреднённая формула липидов микроводоросли имеет вид

С48Н92О6 или С24Н46О3.

Приведя индексы полученной формуле к одному C-молю, получим

СН1,92О0,13.

2. Уточним формулу Стоутхамера для биомассы микроводоросли, содержание липидов в которой составит 30% от сухих веществ:

45

Усреднённая формула С-моля биомассы хлореллы, синтезирующей около 30% липидов в сухом веществе, примет вид

СН1,84О0,39N0,14.

3. Рассчитаем количество углеродного питания (углекислого газа), необходимого для получения 1 г биомассы [14]:

Массовая доля углерода в углекислом газе

Масса СО2, необходимого для получения 1 г биомассы, составит mCO2 =1·00,,27354 =1,98 (г).

Если использовать газовоздушную смесь (гвс) с содержанием углекислого газа 0,8%, то необходимое количество газовой смеси на производство 1 тонны биомассы составит

Gгвс = 1,98 / 0,008 = 247,5 (т).

Объём используемой гвс

VCO2 = 22,4·247500 / (44·0,008) = 15 750 (л) = 15,75 (м3).

46

3. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТОВ ИЗ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

3.1. МЕТОДЫ ОТДЕЛЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ ОТ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ

Переработка накопленной биомассы микроводорослей начинается с процесса отделения биомассы от водных растворов. Технология сбора и обезвоживания микроводорослей должна стремиться к максимальному энергосбережению для снижения себестоимости готового продукта [3, 7, 17]. На сегодняшний день рассматриваются несколько способов обезвоживания биомассы микроводорослей:

1)сепарация или центрифугирование;

2)фильтрация;

3)флокулирование;

4)флотация.

При сепарации и центрифугировании суспензия клеток помещается в поле центробежных сил. При центрифугировании частицы суспензии оседают на стенках осадительных центрифуг. При сепарировании жидкость движется между вращающимися коническими тарелками. В процессе вращения частицы биомассы отбрасываются по направлению от центра вращения, сползают по коническим тарелкам к переферии, формируя у внутренней стенки корпуса слой сгущённой биомассы, при этом осветлённая жидкость движется вверх (рис. 9). Осаждённые клетки остаются живыми и сохраняют свои биохимические свойства [7, 17, 18].

47

Процесс разделения в поле центробежных сил оценивается по показателю, называемому фактор разделения Фр. Фактор разделения показывает, во сколько раз ускорение центробежного поля больше ускорения свободного падения. У обычных центрифуг этот фактор составляет до 3500, у суперцентрифуг – свыше 5000…7000, у ультрацентрифуг – до 20 000.

Центрифугирование и сепарация являются процессами с высоким энергопотреблением. В условиях промышленного культивирования микроводорослей для разделения большого количества суспензии может потребоваться значительное число единиц оборудования.

Фильтрация – это задержание взвешенных частиц пористой перегородкой под действием разности давления жидкости до и после перегородки [7, 17]. Если частицы задерживаются самой перегородкой, размеры отверстий в которой меньше размера частиц, такая фильтрация называется ситовой. Если размер отверстий в перегородке больше размера частиц, такая фильтрация называется через слой осадка – первые частицы проскакивают через перегородку, а затем на перегородке формируется слой осадка, который служит перегородкой (рис. 10).

Фильтрация является процессом энергоёмким и длительным по времени; требуется регулярная замена фильтрующих перегородок.

Флокулирование – это процесс, основанный на физиологической способности микроорганизмов оседать в процессе культивирования. Её нельзя отождествлять с осаждением клеток, являющимся физическим процессом [19].

Этот метод перспективен для выделения микроводорослей сам по себе, либо может быть направлен на снижение затрат при фильтрации. Организация процесса флокулирования предполагает применение реаген- тов-осадителей.

Рис. 10. Схемы фильтрации:

а– через ситовую перегородку;

б– через слой осадка

48

1.Коагулянты. К коагулянтам относятся сернокислое железо, трёххлористое железо, сернокислый алюминий, оксихлорид алюминия, сернокислый марганец и др. Внесение этих реагентов в суспензию микроводорослей вызывает изменение заряда поверхности клеток, их агломерацию и последующую седиментацию биомассы в культуре. Недостатком такого метода является то, что коагулянты содержат ионы токсичных металлов,

атакже изменяют pH культуральной жидкости, делая её не пригодной для повторного использования.

2.Флокулянты. Значительный интерес представляют гидрофильные флокулянты на основе полимеров, например, полиакриламида или хитозан. Флокулянты широко применяются для обезвоживания осадков от избытка активного числа очистных сооружений хозяйственно-бытовых сточных вод и не являются токсичными. Однако при использовании флокулянтов могут возникнуть сложности, поскольку, помимо клеток микроводорослей, они могут флокулировать взвешенные частицы и компоненты питательной среды, присутствующие в культуральной жидкости. Присутствие балластных веществ в полученной сгущенной суспензии затруднит её дальнейшую переработку.

3.Биофлокулянты. Биофлокулянтами могут выступать микроорганизмы, например, бактерии, диатомовые водоросли и др. Применение их ограничено, поскольку биофлокулирующие организмы требуют введения в культуральную жидкость дополнительных питательных веществ, а также способны вызывать заражение самой монокультуры микроводоросли.

4.Автофлокуляция. Это процесс самопроизвольного осаждения микроводорослей, может происходить при изменении условий окружающей среды, например, увеличении pH среды, изменении осмотического давления и др. Кроме того, эффективность флокуляции может повышаться при внесении в суспензию автофлокулирующих микроводорослей, не требующих введения дополнительных химических реактивов и специальных условий культивирования.

Следует отметить, что сам механизм флокуляции остаётся недостаточно изученным.

Флотация – это процесс выделения клеток микроорганизмов из культуральной жидкости за счёт их адгезии (прилипания) к поднимающимся в жидкости пузырькам газа, сбора пены и её конденсации. Собранная пена отстаивается, в результате чего происходит её осушение [7]. По способу организации различают барботажную флотацию, напорную флотацию и электрофлотацию.

При барботажной флотации через культуральную жидкость пропускают пузырьки газа, формирующие пену; для интенсификации процесса в культуральную жидкость вносят флотореагенты, представляющие собой ПАВ.

49

При напорной флотации жидкость, находящуюся под давлением, насыщают газом, а затем осуществляют сброс давления. Образующиеся при этом пузырьки оказывают флотационное действие.

Электрофлотация – это процесс образования пены под действием электролиза. При электролитическом разложении воды на аноде выделяются пузырьки кислорода, а на катоде – пузырьки водорода, которые и формируют пену. Электрофлотация является наиболее эффективным изо всех флотационных процессов, но при организации её требуется частая замена изношенных электродов. Кроме того, электрофлотация является энергоёмким процессом.

3.2. МЕТОДЫ РАЗРУШЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ОБОЛОЧЕК МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

Поскольку целевые продукты биосинтеза микроводорослей – липиды, белки, витамины и др. – являются внутриклеточными продуктами, выделению их предшествует разрушение или дезинтеграция клеточной стенки. Дезинтеграция клеток – это процесс необратимого анатомического нарушения целостности клеток. Разрушение клеточных стенок способствует как лучшему проникновению экстрагента, так и выходу целевых продуктов из клетки, в окружающую среду [20].

В естественных условиях разрушение клеток может происходить под влиянием внешних и внутренних факторов: физических, химических, биологических и генетических.

При подборе методов дезинтеграции следует учитывать структуру клеточных оболочек, их механические и биохимические характеристики (сопротивление нагружению, деформации, разрушению, формообразование и т.д.). Клеточная оболочка является сложным структурным межфазным граничным образованием, служит для поддержания пространственного единства клетки и обеспечивает устойчивость к колебаниям осмотического давления, проницаемость для большого числа веществ, обладает электрическим зарядом, большим комплексом ферментов и специальных структур, что позволяет клетке адаптироваться к непрерывно меняющимся условиям внешней среды.

Виды и методы дезинтеграции, применяемые в биотехнологии, представлены на схеме (рис. 11) [20].

Для разрушения клеточных оболочек микроводорослей на практике применяются следующие методы.

1. Баллистическое воздействие. Чаще всего, применяются дезинтеграторы со свободными мелющими телами (мельницы со стеклянными бусами). Разрушение клеточной оболочки происходит при непосредственном механическом контакте мелющих тел и клеток. Недостатком баллистических методов являются энергоёмкость и сложность оборудования.

50