Генерализованные инфекции неонатального периода. Учебное пособие
.pdfпоступающие с током лимфы, плохо задерживаются в синусах, слабо захватываются макрофагами, чем и объясняется легкость развития генерализованных и септических форм инфекции.
При внедрении микробов через слизистые происходит их разрушение в результате действия лизоцима, -лизина и активации комплемента по альтернативному и лектиновому пути. Активированные компоненты комплемента привлекают фагоциты в участок внедрения микробов. Через 4–6 ч и в течение 96 ч после внедрения микробов начинает действовать ранний индуцибельный ответ, обусловленный синтезированными макрофагами, нейтрофилами и дендритными клетками цитокинами – TNF- , IL-1, IL-8, IL-12, IFN- , GM-CSF и др.
Антигены поглощаются и перерабатываются макрофагами и незрелыми дендритными клетками, затем специфическая часть антигена передается Т- и В-лимфоцитам, реализующим соответственно специфический клеточный или гуморальный иммунный ответ. Формирование специфического иммунного ответа значительно отстает от реакций врожденного иммунитета, и его эффекты проявляются начиная с 5–7-го дня от начала воспаления. В случае адекватного адаптивного иммунитета происходит связывание антигенов, нейтрализация продуктов воспаления и выздоровление от инфекции, а также образование клеток памяти, в последующем участвующих в нейтрализации данного патогена.
Центральные органы иммунной системы – красный костный мозг и тимус – у новорожденных имеют максимальную массу по сравнению со взрослыми, в них лимфоциты дифференцируются в зрелые неиммунные лимфоциты, так называемые наивные лимфоциты: В-лимфоциты дифференцируются до зрелых в костном мозге, а Т-лимфоциты – в тимусе. Зрелые наивные В-лимфоциты попадают в периферические лимфоидные органы, там они под влиянием антигена превращаются в плазматические клетки, возвращаются в костный мозг, где активно продуцируют антитела. Красный костный мозг до 4–5 лет находится во всех плоских и трубчатых костях. С возрастом красный костный мозг вытесняется желтым, содержащим жировые клетки.
Тимус закладывается уже на 2-м месяце внутриутробной жизни и заканчивает свое формирование к концу 3-го месяца. Т-лимфоциты поступают в тимус из костного мозга в виде пре-Т-лимфоцитов. В тимусе отбираются Т-лимфоциты (CD4+ и CD8+) и уничтожаются их варианты, высокоавидные к антигенам собственных тканей. Гормоны тимуса способствуют функциональному созреванию Т-лимфоцитов и повышают секрецию ими цитокинов. С возрастом тимус подвергается инволюции.
11
1.1. Врожденный иммунитет
Гуморальные факторы врожденного иммунитета
Комплемент является основным гуморальным компонентом врожденного иммунного ответа. Систему комплемента составляют более 20 сывороточных белков, которые находятся в крови в неактивном состоянии и могут каскадно (непосредственно друг за другом) активироваться при наличии в организме чужеродного антигена. Активированные компоненты комплемента вызывают различные эффекты:
разрушают измененные клетки организма, грамотрицательные бактерии и оболочечные вирусы с помощью мембраноатакующего комплекса, формирующего трансмембранные каналы в мембране клетки или вируса;
усиливают фагоцитоз за счет образования на объекте фагоцитоза опсонинов (C3b, C4b и др.), взаимодействующих с рецепторами фагоцитов;
участвуют в анафилактических реакциях в виде анафилотоксинов (C5a, C3a), вызывающих высвобождение гистамина из тучных клеток;
вызывают хемотаксис – направленное движение клеток (C5a является мощным хемоаттрактантом);
изменяют физико-химические свойства иммунных комплексов. Активация комплемента происходит по классическому, альтерна-
тивному и лектинзависимому пути.
Классический путь активации – антителозависимый, начинается с присоединения С1 к комплексу антиген – антитело, затем происходит последовательная активация компонентов с образованием конечного продукта классического пути – С5-конвертазы.
Альтернативный путь активации происходит без участия антител (комплекса антиген – антитело) и без участия С1, С4, С2. Активаторами альтернативного пути являются компоненты микробов и агрегаты различных белков. Начинается альтернативный путь с С3компонента, конечным продуктом является также С5-конвертаза.
Лектиновый путь активируется маннозосвязывающим белком – лектином крови, который относится к острофазовым белкам, опсонинам крови, ускоряющим фагоцитоз бактерий. Лектин крови является структурным аналогом С1q, связывается с маннозой микробной клетки с последующим расщеплением С4-, С2-компонентов и образованием С3-конвертазы классического пути.
Образовавшиеся С5-конвертазы классического и альтернативного пути связывают С5-компонент и расщепляют его на С5a- и С5bфрагменты. С5b-фрагмент связывает С6- и С7-компоненты с образованием гидрофобного комплекса С5b67, который встраивается в
12
мембрану клетки. Далее после присоединения С8 и С9 формируется мембраноатакующий комплекс, который образует канал-пору к клеточной мембране, что приводит к лизису клетки.
У новорожденного ребенка активность системы комплемента низкая (около 50% от активности у взрослого), и это объясняет недостаточную опсоническую активность крови новорожденных и слабость фагоцитарной антибактериальной защиты. Однако на первом месяце жизни она быстро возрастает, достигая уровня взрослого человека к шестимесячному возрасту. Также для периода новорожденности характерен низкий уровень С3-компонента.
Интерфероны – гликопротеины, вырабатываемые клетками в ответ на вирусную инфекцию, блокируют репродукцию вируса в других клетках и участвуют во взаимодействии между клетками иммунной системы.
Различают две серологические группы интерферонов: I типа – IFN- , IFN- , IFN- ; II типа – IFN- .
Интерфероны I типа – доиммунные интерфероны, отличаются по структуре, но обладают практически одинаковым механизмом действия, оказывают противовирусный и противоопухолевый эффект. Синтез их индуцируется двунитевыми РНК, образующимися при репродукции вируса в клетке. Интерфероны I типа продуцируют лимфоидные дендритные клетки, продукция усиливается за счет пирогенного действия IL-1 и понижения рН в межклеточной жидкости на фоне повышения температуры; способны подавлять трансляцию белков клетки и вируса, а также индуцировать программированную клеточную гибель некоторых опухолей; индуцируют экспрессию молекул МНС I класса, усиливают продукцию NK-клетками IFN- и литическое действие NK на вирусинфицированные и трансформированные клетки.
Интерферон II типа – IFN- (иммунный интерферон). Он продуцируется Т-лимфоцитами (Тh-1, СD8+CTL и NK), повышает активность Т- и В-лимфоцитов, моноцитов/макрофагов, нейтрофилов и NK, стимулирует дифференцировку Th-0 в Th-1, вместе со своим антагонистом IL-4 поддерживает баланс Th-1/Th-2. Кроме того, IFNрегулирует апоптоз целого ряда нормальных, а также инфицированных и трансформированных клеток.
Сразу после рождения активность процессов продуцирования интерферонов относительно низкая, максимума она достигает к 12–16 годам.
Интерлейкины – цитокины, ответственные за межклеточные взаимодействия между лейкоцитами. Описано более 30 интерлейкинов, эффекты многих из них дублируются, образуя «цитокиновую сеть».
Фактор некроза опухолей – внеклеточный белок, многофункциональный провоспалительный цитокин, синтезирующийся в основном
13
моноцитами и макрофагами. Различают собственно TNF- и лимфотоксины (TNF- ).
TNF-a продуцируется активированными моноцитами/макрофагами и дендритными клетками, Т- и В-лимфоцитами, нейтрофилами, NK, кератиноцитами, астроцитами, эндотелиальными и гладкомышечными клетками. Он обусловливает выраженную потерю массы тела и развитие септического шока, гипертермии, коллапса и ДВС-синдрома, индуцирует синтез макрофагами IL-1, IL-6 и образование печенью белков острой фазы, стимулирует ангиогенез, может вызывать геморрагический некроз ряда опухолей и другие эффекты.
TNF-b продуцируется активированными Т- и В-лимфоцитами, обладает аналогичным действием, усиливает апоптоз клеток.
Колониестимулирующие факторы (KSF) – цитокины, регулирующие деление, дифференцировку костномозговых стволовых клеток и предшественников клеток крови. Кроме того, они могут стимулировать дифференцировку и функциональную активность некоторых клеток вне костного мозга.
Гранулоцитарный KSF (G-KSF) продуцируется макрофагами, фибробластами и эндотелиальными клетками, стимулирует деление и дифференцировку стволовых клеток, усиливает активность нейтрофилов и эозинофилов.
Макрофагальный KSF (M-KSF) вырабатывается лимфоцитами, моноцитами, фибробластами, эпителиальными и эндотелиальными клетками, усиливает пролиферацию предшественников макрофагов в костном мозге.
Гранулоцитарно-моноцитарный KSF (GM-KSF) продуцируется макрофагами, Т-лимфоцитами, фибробластами и эндотелиальными клетками, стимулирует деление, дифференцировку и активность предшественников гранулоцитов и макрофагов, пролиферацию Т-лимфоцитов, способствует дифференцировке кроветворных предшественников в антигенпрезентирующие дендритные клетки, усиливает секрецию IL-1, IL-6 и TNFклетками системы мононуклеарных фагоцитов.
Трансформирующий фактор роста b (TGF-b) – полифункциональный фактор роста, к которому относятся также факторы роста фибробластов, тромбоцитов, эндотелия, инсулиноподобный фактор роста, эпидермальный фактор роста и др. Он продуцируется многими клетками организма, в том числе некоторыми опухолевыми клетками, подавляет активность моноцитов/макрофагов, снижая их цитотоксическую и цитокинпродуцирующую активность, а также экспрессию на их поверхности молекул МНС, действуя синергично с другими макрофагдеактивирующими цитокинами (IL-4, IL-10,
14
IL-13). TGFотносится преимущественно к противовоспалительным цитокинам, регулирует процессы апоптоза нормальных и трансформированных клеток, угнетает апоптоз Th-1, а вместе с IL-2 – и апоптоз Th-2, благодаря чему играет важную роль в генерации клеток памяти.
Хемокины – низкомолекулярные цитокины, ответственные за хемотаксис лейкоцитов в очаг воспаления, регулируют подвижность лейкоцитов. Хемокины расположены в межклеточном матриксе, являясь «путеводителем» для привлекаемых лейкоцитов, могут вызывать дегрануляцию клеток и повышать экспрессию молекул адгезии. Хемокины – индуцибельные молекулы, так как не экспрессируются в неактивированных клетках. Они отличаются происхождением: например, RANTES продуцируется активированными Т-лимфоцитами, эндотелием, тромбоцитами, а GRO- , GRO- , GRO- – моноцитами, эндотелием, фибробластами. По химической структуре хемокины разделяются на несколько групп.
Сразу после рождения активность процессов продуцирования интерферонов относительно низкая, максимума она достигает к 12–16 годам.
Клеточные факторы врожденного иммунитета
Основным звеном в клеточных реакциях врожденного иммунитета являются фагоциты – нейтрофилы и моноциты/макрофаги, которые поглощают и элиминируют из организма различные патогены. Распознавание антигена обеспечивается дендритными клетками. Фагоциты происходят из клеток-предшественников крови под влиянием цитокинов: G-KSF способствует дифференцировке в гранулоциты, GM-KSF – в моноциты и дендритные клетки. Нейтрофилы находятся в крови до 7 ч, а затем скапливаются в капиллярах, чтобы сразу выйти за пределы кровотока в сторону хемотаксических факторов. Моноциты находятся в кровотоке около 12 ч. Поступая в ткань, моноциты формируют популяцию тканевых макрофагов: макрофаги соединительной ткани (гистиоциты), звездчатые ретикулоэндотелиоциты печени (купферовские клетки), остеокласты костной ткани, альвеолярные, плевральные, перитонеальные макрофаги, микроглия ЦНС, синовиоциты типа А и др. Количество моноцитов в тканях в 400 раз больше, чем в кровеносном русле. Моноциты и тканевые макрофаги объединяют в систему мононуклеарных фагоцитов. Помимо фагоцитоза макрофаги способны продуцировать большое количество биологически активных веществ – цитокинов, таких как TNF, IL-1, имеющих важное значение в развитии специфического и неспецифического иммунитета, комплемент, интерферон.
15
Основной функцией фагоцитов является фагоцитоз – поглощение гранулоцитами (нейтрофилами, эозинофилами, базофилами) и моноцитами/макрофагами частиц диаметром 0,1 мкм, в том числе бактерий или крупных макромолекулярных комплексов. Фагоцитоз является разновидностью эндоцитоза – поглощения веществ из окружающей среды через специальные участки в мембране. Поглощение маленьких жидких частиц называется пиноцитозом.
Фагоцитоз включает следующие этапы:
1)активация фагоцита;
2)хемотаксис;
3)прикрепление (адгезия) к объекту фагоцитоза;
4)поглощение;
5)киллинг и переваривание, процессинг (переработка) объекта фагоцитоза.
Фагоцитированный микроб разрушается по двум механизмам – кислородзависимому и кислороднезависимому.
Кислородзависимый механизм обусловлен системой миелопероксидазы и развитием респираторного взрыва в ответ на активацию
эндотоксинами бактерий или провоспалительными цитокинами (IFN- , IL-1 , TNF- ). В фагоците образуются токсичные антими-
кробные формы кислорода: перекись водорода H2O2, супероксид-
– –
анион O2, гидроксильный радикал ОН , гипоиодит и гипохлорид, синглетный кислород, а также оксид азота NO, образующийся из аргинина при участии NO-синтетазы.
Кислороднезависимый механизм включает протеиназы, катионные белки дифенсины и лизоцим, разрушающий пептидогликан клеточной стенки бактерий, а также лактоферрин, связывающий железо, необходимое для бактерий.
Фагоцитоз может быть завершенным, при котором фагоцитированные бактерии разрушаются, и незавершенным, при котором микробы не погибают, сохраняя способность к размножению. Выживанию микробов способствуют подавление слияния фагосомы, содержащей микробы, с лизосомой (туберкулез, лейшманиоз, токсоплазмоз), устойчивость микроба к лизосомальным ферментам (гонококки), выход микробов из фагосомы и персистенция их в цитоплазме клеток (листерии, риккетсии).
У новорожденных фагоцитоз, как правило, незавершенный, поскольку достаточно развиты только процессы поглощения, а процессы лизиса развиваются постепенно на протяжении первого полугодия жизни. Этим объясняется высокая частота инфекционной патологии, тяжелое течение, частое возникновение осложнений.
Гранулоциты (нейтрофильные полиморфноядерные лейкоциты, эозинофилы, базофилы) являются одним из основных факторов защиты при острых инфекциях. Миграция нейтрофилов в ткани осуществляется под действием факторов хемотаксиса, которые проду-
16
цируются в местах воспаления (некоторые компоненты системы комплемента, калликреин, цитокины, продуцируемые Th-1, факторами хемотаксиса, а также тучными клетками). Для проникновения в ткани нейтрофилы синтезируют и экспрессируют на своей поверхности большое количество адгезивных молекул. Фагоцитарная активность гранулоцитов резко возрастает в месте воспаления. С морфологической точки зрения механизмы фагоцитоза, осуществляемые мононуклеарами и нейтрофилами, идентичны. Нейтрофилы содержат катионные антимикробные пептиды (дефенсины, кателицидины), вызывающие деполимеризацию мембран бактерий, грибов, простейших и вирусов с образованием дефектов и гибелью патогенов.
Естественные киллеры (NK) – особые лимфоциты, не имеющие молекул CD3 и распознающие клетки-мишени иначе, чем Т-лимфоциты. NK-клетки циркулируют только в крови, составляют 10% ее лимфоцитов. Маркерами NK-лимфоцитов являются молекула адгезии CD56 и рецептор для Fc-фрагмента IgG (CD16).
NK уничтожают клетки-мишени, используя два пути: лектиновый
иантителозависимой клеточной цитотоксичности. Они распознают
иубивают клетки-мишени, которые в данный момент не экспрессируют или содержат измененные молекулы МНС I класса, что часто бывает при вирусных инфекциях и злокачественных опухолях. Нормальные молекулы МНС I класса ингибируют NK-клетки. NKлимфоциты могут вызывать несекреторный и секреторный лизис клетки-мишени. Несекреторный лизис предполагает включение механизмов апоптоза, но чаще происходит секреторный лизис, обусловленный перфоринзависимым лизисом.
NK-клетки могут уничтожать клетки, покрытые антителами, благодаря взаимодействию Fc-рецепторов с Fc-фрагментом антител – антителозависимая клеточная цитотоксичность. Имеется две субпопуляции NK:
субпопуляция, циркулирующая в крови (CD56мало/CD16+) и
участвующая в антителозависимой клеточной цитотоксичности;
субпопуляция с фенотипом CD56много/CD16– (так называемые pit-клетки), которая находится в печени, слизистой оболочке матки, децидуальной оболочке; рit-клетки убивают любые лимфоциты, которые активируются пищевыми антигенами и антигенами плода, обусловливая толерантность к этим антигенам.
1.2. Приобретенный иммунитет
Несмотря на все активные действия неспецифического иммунитета, он не в состоянии изолированно справиться с инфекцией без помощи специфического (приобретенного) иммунитета, который связан с Т- и В-лимфоцитами.
17
Специфический иммунный ответ начинается с презентации антигена Т-лимфоцитам, осуществляемой APC в виде комплекса МНС – антигенный пептид. Презентация антигена осуществляется
врезультате нескольких этапов:
1)поглощение антигена APC;
2)расщепление антигена внутри клетки (процессинг антигена) до антигенных пептидов;
3)связывание образовавшихся антигенных пептидов с молекулами МНС I или II класса;
4)выход антигенных пептидов с молекулами МНС на поверхность клетки для контакта с антигенраспознающими рецепторами Т-лимфоцитов.
Молекулы МНС I класса презентируют эндогенные антигены,
образованные внутри клетки (антигены вирусов, опухолей, внутриклеточных бактерий и др.), СD8+ цитотоксическим лимфоцитам.
Молекулы МНС II класса презентируют антигенные пептиды экзогенной природы хелперным CD4+ Т-лимфоцитам.
Профессиональными APC для лимфоцитов являются дендритные клетки (DC), макрофаги, В-лимфоциты и некоторые другие клетки, способные при активации экспрессировать МНС и цитокины (эндотелий, фибробласты, кератиноциты и др.). Основными представителями APC являются DC костномозгового происхождения. Их предшественники циркулируют в крови и лимфе и дают начало незрелым DC, находящимся в коже, слизистых и в маргинальных зонах белой пульпы селезенки. Незрелые DC мигрируют в участки внедрения микробов, опухолевого роста, повреждения тканей, вступают в контакт с антигеном, поглощают его и начинают созревать. Зрелые DC мигрируют в Т-клеточные зоны региональных лимфоузлов или белой пульпы селезенки, формируют пул APC, которые активируют наивные Т-лимфоциты. Основным маркером зрелых DC является молекула CD83. Дендритные клетки имеют TLR, позволяющие им распознавать молекулы-паттерны, образуемые микробами.
Дендритные клетки делятся на миелоидные 1-го типа (DC1) и лимфоидные (плазмоидные) 2-го типа (DC2). Миелоидные DC располагаются в коже (клетки Лангерганса, дермальные DC), слизистых оболочках и интерстиции органов (сердце, почках и др., кроме иммунологически привилегированных – головного мозга, роговицы глаз и яичек). Миелоидные DC высокомобильны: захватив и переработав антиген, они перемещаются в тимусзависимые зоны лимфоузлов и презентируют его наивным Т-лимфоцитам. Лимфоидные DC берут начало от лимфоидных/плазмоцитоидных DC, обнаруживаются в крови, лимфоузлах, селезенке и тимусе. В тимусе они отвечают за отрицательную селекцию Т-лимфоцитов, реагирующих на собственные ткани.
18
Дендритные клетки некостномозгового происхождения фиксированы в лимфоузлах, селезенке, лимфоидной ткани слизистых оболочек, образуя стабильную сеть. Они не имеют молекул МНС, не поглощают и не перерабатывают антиген, а презентируют его на своей поверхности В-лимфоцитам в виде комплекса антиген – антитело.
Гуморальные факторы приобретенного иммунитета
Участие гуморального звена обеспечивается за счет синтеза антител, специфичных к конкретным антигенам. Антитела (иммуноглобулины) синтезируются В-лимфоцитами, созревающими в костном мозге, где они подвергаются негативной и позитивной селекции. Позитивная селекция – отбор В-клеток с низкоаффинными рецепторами к МНС II класса. Отрицательная селекция – уничтожение лимфоцитов, прошедших положительную селекцию, если они имеют высокоаффинные рецепторы к собственным антигенам.
Созревшие В-лимфоциты рециркулируют по периферическим лимфоидным органам. Встречая антиген, они исполняют роль антигенпрезентирующей клетки. Антиген в комплексе с МНС II класса представляется Th-2, при взаимодействии молекулы CD40 В-лимфоцита с рецептором CD40R Th-2 запускается пролиферация и дифференцировка В-лимфоцитов, трансформация их в плазматические клетки и синтез иммуноглобулинов. Пролиферация В-лимфоцитов усиливается под воздействием IL-2. Интерлейкины IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, продуцируемые Th-2, участвуют в переключении синтеза классов иммуноглобулинов. Кроме описанной главной популяции В-лимфоцитов, обозначаемой как В2 (CD5–), имеются В1-лимфоциты (CD5+), появляющиеся первыми при становлении иммунной системы. Они находятся в брюшной и плевральных полостях, секретируя полиспецифические, не связанные с иммунизацией IgM-антитела, взаимодействуя с неродственными антигенами.
Иммуноглобулины состоят из двух пар полипептидных цепей – двух идентичных тяжелых Н-цепей и двух идентичных легких L-цепей, связанных дисульфидной связью. Эти цепи имеют константные и вариабельные участки. L-цепи одинаковы у всех классов иммуноглобулинов, тяжелые цепи – разные ( , μ, , , ). По типу тяжелой цепи различают пять классов иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. Мономеры IgA и IgМ могут связываться друг с другом. Папаин расщепляет молекулу иммуноглобулина на два одинаковых антигенсвязывающих фрагмента – Fab и Fc. Fcфрагмент участвует в классическом пути активации комплемента, может связываться с макрофагом, нейтрофилом, NK, связывает
19
комплемент при образовании комплекса антиген – антитело, взаимодействует с мембранами клеток и участвует в переносе IgG через плаценту. Разные классы антител различаются по своим свойствам.
Синтез IgG начинается с 22-й недели внутриутробного развития, составляет у взрослых около 80% антител сыворотки крови, мономер, имеет четыре подкласса (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), период полураспада – 7–23 дня в зависимости от подкласса. Подклассы IgG1 и IgG3 могут индуцировать фагоцитоз, IgG1, IgG2 и IgG3 способны фиксировать комплемент, IgG4 – антирезусные антитела. Класс IgG содержит большую часть противовирусных антител, антител к бактериальным токсинам и грамположительным бактериям. Антитела всех подклассов IgG способны проникать через плаценту. Максимальное их количество поступает от матери к плоду в последние недели беременности, чем объясняется их низкое содержание или почти полное отсутствие у недоношенных. У доношенного ребенка при рождении содержание IgG в пуповинной крови соответствует таковому у матери или даже превышает его уровень. Сразу после рождения начинается процесс катаболизма пассивно полученных от матери IgG, и уровень их постепенно снижается, достигая минимальных значений на 6–9-м месяце жизни. Уровня взрослого человека они достигают лишь на 5–6-м году жизни ребенка.
Синтез IgM начинается на 12–15-й неделе внутриутробного развития и к 12–24-му месяцу жизни достигает уровня взрослого, составляет около 6–10% антител сыворотки, период полураспада – около 5 дней, пентамер. В состав IgM входят антитела против грамотрицательных бактерий и, частично, вирусов, а также против растворимых антигенов и токсинов. Они обладают высокой агглютинирующей активностью. Первый класс антител, продуцируемых при иммунном ответе, Fc-фрагмент может участвовать в классическом пути активации комплемента. Мономеры IgM имеются на мембранах В-лимфоцитов (mIg). Антитела класса IgM являются высокомолекулярными и поэтому не проникают через плаценту, т.е. его появление в крови после рождения свидетельствует о внутриутробной инфекции.
IgA сывороточный составляет около 12% антител сыворотки крови, имеет два подкласса (IgA1, IgA2), период полураспада – 5 дней. Секреторный IgA (sIgA) является димером за счет секреторного компонента, защищающего sIgA от разрушения ферментами. sIgA находится на слизистых оболочках, в слюне, молозиве и грудном молоке. IgA входит в состав женского молозива, слюны, слез, носового и бронхиального секрета, слизистой кишечника. Эти иммуноглобулины препятствуют инвазии бактерий и вирусов в организм.
20