ДНК происходит задержка в клеточном цикле, в течение которого происходит корректировка. Точками контроля являются переходы G1-S и G2-M. Существует также особая точка контроля при переходе от метафазы в анафазу. Увеличение количества нарушений при воздействии генотоксикантов приводит к задержке клеточного цикла в точках контроля, что отражается на количестве делящихся клеток и на продолжительности фаз клеточного цикла.

Как следствие, для уменьшения возможных ложноотрицательных ответов при выявлении генотоксических и канцерогенных факторов удобно использовать такой показатель как митозмодифицирующая активность изучаемого фактора, которая определяется по уровню митотической активности ткани и относительной длительности фаз митоза. Исследование митозмодифицирующей активности позволяет выявить ранние изменения цитогенетической системы организма, вызванные комплексом различных нарушений.

Митозмодифицирующий эффект в меристеме корня растений исследуется параллельно с определением частоты хромосомных аберраций. Следовательно, в одном тесте можно зарегистрировать широкий спектр нарушений генетических структур и процессов, что упрощает исследование и уменьшает затраты на его проведение

(Тарасов, 1994).

Таким образом, использование растительной тест-системы позволяет не только сказать о количественном воздействии изучаемого фактора (-ов) на живой объект, но и определить качественный характер воздействия по поражаемым участкам генетического материала и другим показателям.

1.7.6. Метод ана-телофазного анализа хромосомных аберраций

Ана-телофазный анализ – генетический тест, основанный на визуальном учете хромосомных аберрации (повреждения хромосом) на стадии анафазы и телофазы митотического цикла клетки. Ана-телофазный анализ простой, экономичный, не требует знания кариотипа и идентификации хромосом. Он позволяет выявить лишь определенные типы хромосомных аберраций, но его чувствительность вполне достаточна для заключения «мутагенен» или «не мутагенен» фактор. Ана-телофазный анализ является достаточно чувствительным, корректным и удобным на первом этапе экотоксикогенетического исследования.

Среди наиболее ранних исследований, в которых данный анализ был применен,

следует отметить эксперименты на луке (A. Levan). До настоящего времени применяется как основной метод генетического анализа для растительной тест-системы

43

Allium test, в которой исследуется влияние различных генотоксикантов на клетки корневых меристем.

Ана-телофазный анализ высокочувствителен при тестах самой разной направленности. Будь то пробы субстратов из окружающей среды (вода, почва, донные отложения) или же вещества антропогенного происхождения, а так же излучения различного спектра (как ионизирующие, так и неионизирующие). Кроме того достоинством данного анализа является его универсальность (он применим практически во всех случаях, когда есть митозы) и простота в приготовлении препаратов, что очень важно при работе с клетками животных.

Включает анализ под микроскопом препарата клеток, зафиксированных и окрашенных на стадии пролиферации. Существует ряд вариаций ана-телофазного анализа. Так, согласно оригинальному варианту анализа, описанному (Fiskesjo G., 1985)

на препарате подсчитываются первые 100 анафазных и телофазных клеток, из которых отмечаются аберрантные. Позднее стал применяться иной вариант (И.М. Прохорова, 2003), который учитывает все анафазы и телофазы на препарате, среди которых отмечаются аберрантные. Пригодными для учета хромосомных аберраций являются не очень ранние анафазы и ранние телофазы. Поскольку делящаяся клетка не всегда распластывается на препарате по продольной оси деления, то при отборе клеток,

пригодных для подсчета хромосомных аберраций, надо принимать во внимание расстояние между дочерними ядрами - оно должно быть не меньше размера одного из них.

На стадии анафазы и телофазы подсчитываются две классические для данного анализа категории аберраций, представляющие собой отставший от полюсов хромосомный материал (ацентрические фрагменты и кольца, отставшие хромосомы) и

мосты. Все они достаточно хорошо видны визуально и различимы. Очень часто в отдельную категорию включаются и подсчитываются отставания и забегания,

указывающие на изменения ахроматинового веретена деления.

1.Ацентрические фрагменты и кольца могут быть одиночными и парными. Они располагаются между дочерними звездами или в стороне от них. Основная задача сводится к распознаванию одиночности или парности и к отличию их от отставших хромосом. Одиночные фрагменты представляют собой фрагменты хроматидного происхождения. Потеря одного фрагмента из пары (хромосомного происхождения) –

явление, очевидно, редкое, поскольку притяжение между сестринскими хроматидами сохраняется и на стадии анафазы. По этой же причине маловероятно предположение,

44

что одиночный фрагмент может происходить за счет слияния сестринских хроматид

парного фрагмента и развертывания их по длине.

2.Парные фрагменты – это фрагменты изохроматидного или хромосомного происхождения. О соединении поврежденных концов сестринских хроматид, а не об отставшей хромосоме можно говорить только при условии, если парный фрагмент имеет дугообразный вид. Следует отметить, что оценка этого признака крайне затруднительна и поэтому не может проводиться во всех случаях.

3.Мосты иногда разделяют на хромосомные и хроматидные. Под хромосомным мостом понимают дицентрическую хромосому: он состоит из двух хроматид, чаще всего перекрещенных. Хроматидный мост - дицентрическая хроматида, поэтому он виден как одиночный. По "толщине" моста нельзя судить о его хромосомном или хроматидном характере. К сожалению, не всегда можно дифференцировать характер моста и поэтому вряд ли целесообразно проводить такое разделение при использовании тотального метода окрашивания хромосом, не позволяющего идентифицировать отдельные хроматиды.

4.Отставшие хромосомы или хроматиды чаще всего распознаются легко, так как в них можно видеть центромеру либо неоднородность структуры, что нехарактерно для фрагментов. Наибольшие трудности возникают при необходимости отличить отставшую метацентрическую хроматиду от акроцентрической хромосомы. Вместе с тем ответ на этот вопрос важен, потому что в результате отставания хромосомы образуются две анеуплоидные клетки, а в результате отставания хроматиды одна анеуплоидная и одна нормальная клетка.

Абсолютного стандарта для учета аберраций и для представления полученных результатов быть не может. На практике встречаются сочетания разных типов аберраций в одной и той же клетке. Теоретически можно ожидать любые сочетания аберраций. Основой этого является асинхронность редупликации наследственного материала. Кроме того попутно другие, реже встречающиеся типы аберраций, такие как мультиполярные митозы и полиплоидии, так же могут регистрироваться.

Для большинства исследований можно рекомендовать следующее:

1.Важным условием при оценке типов (спектра и частоты хромосомных аберраций)

является проведение их учета в первом после действия мутагена клеточном делении.

Это связано с тем, что значительная часть аберраций и аберрантных клеток элиминируется уже после первого деления или приобретает другой вид, хотя некоторые хромосомные аберрации, которые наблюдаются в виде мостов, могут сохраняться в течении 12-15 митотических циклов.

45

2.Не проводить анализ перестроек при наложении клеток и при нарушении целостности их оболочки

3.Принимать во внимание все типы морфологических изменений, учет которых возможен при данной методике

4.Анализировать изменения поклеточно, т.е. регистрировать в протоколе опытов сочетаемость аберраций, встречающихся в каждой клетке.

5.Клетки в которых не удается определить тип аберраций, нужно относить к классу клеток с неразобранными аберрациями; их подсчитывать только в подсчете общего количества аберрантных клеток

6.Быть крайне осторожным при объединениях любого рода (например, данных по отдельным повторностям и данных аналогичных опытов, по точечным фрагментам и кольцам, по дицентрикам и сопутствующим ацентрикам и т.д.). Если правомочность какого-то объединения доказана для некоторого объекта или условий, то для других объектов и условий она должна специально проверяться

7.При представлении данных в статье необходимо указывать число обследованных особей (или повторностей опыта), число проанализированных клеток, число каждого из учитываемых типов аберраций, типы аберрантных клеток и их частоту, число анеуплоидных клеток. Для точного определения необходимо знать структуру

кариотипа изучаемого вида растений или животных в норме.

Для статистической обработки числовых массивов, полученных в результате подсчета клеток, применяются различные стандартные методы статистики, такие как

хи-квадрат тест, t-критерий Стьюдента и дисперсионный анализ. Для фазы статистической обработки данных ана-телофазного анализа могут использоваться программы универсального назначения, такие как Statistica, MS Excel или OO.o Calc

(теперь Libre Office Calc). Но так же могут применяться специфицированные программы, расчетная тематика которых предназначена именно для ана-телофазного анализа. Например, адаптированные варианты книги Excel, такие как электронно-

вычислительная таблица «Allium test – Matrix», созданная Романовским А.В. и

коллегами (Романовский А.В., 2010).

1.7.7. Микроядерный тест

Еще одним из популярных анализов учета хромосомных аберраций является микроядерный тест позволяющий учитывать нарушения в интерфазе клетки.

46

Достоинство этого метода состоит в том, что он, в отличие от ана-телофазного метода позволяет проводить оценку уровня хромосомных нарушений по анализу интерфазного ядра, т.е. не требует наличия клеток в митозе.

Актуальность исследований, включающих идентификацию и регистрацию клеток, имеющих в своем составе микроядра, объясняется тем, что данные структуры часто встречаются при различных заболеваниях, и в результате изменения условий существования организма. Поскольку обнаружение таких образований позволяет использовать их в качестве своеобразного маркера патологических изменений в организме, то проведение исследований, касающихся изучения процессов формирования микроядер следует считать одним из важных вопросов биологии и медицины.

Выявление микроядер в клетках широко используются при различного рода цитологических и гистологических исследованиях. Является информативным методом индикации влияния неблагоприятных факторов окружающей среды, включая действие химических соединений и радиации.

Известно, что микроядра представляют собой небольшие образования,

состоящие из фрагментов хромосом. На стадии телофазы эти фрагменты могут включаться в ядра дочерних клеток или образовывать одиночные или множественные микроядра в цитоплазме. Крупные микроядра формируются при патологических митозах, что обусловлено отставанием отдельных хромосом в метафазе и в анафазе, в

то время как мелкие микроядра встречаются преимущественно при структурных аберрациях хромосом. Кроме того, микроядра могут появляться в следствие апоптоза.

Указанные процессы, лежащие в основе образования микроядер, несомненно,

свидетельствуют о снижении жизнеспособности таких клеток, что является маркером не стабильности их функционирования, активизации процессов воспаления и апоптоза.

Образование микроядер свидетельствует не только об активации апоптоза, но и о наличии повреждений хромосом.

Наиболее важными показателями, определяющими степень влияния различных факторов на изменение структурно-функциональных характеристик клеток, считаются:

результаты микроядерного теста, хромосомный анализ и уровень митотической активности. Показана прямая зависимость между увеличением числа хромосомных аберраций и активностью процесса митоза, что вызывает появление микроядер.

Микроядерный тест можно считать косвенным методом оценки наличия хромосомных повреждений. Например, определение микроядер в лейкоцитах зарекомендовало себя в качестве специфичного и высокоинформативного способа

47

идентификации разрывов хромосом. На основании данных, полученных при исследованиях in vivo и in vitro, было установлено, что показатель, характеризующий появление микроядер более информативен, чем регистрация хромосомных аберраций.

Блокада цитокинеза, которая обусловливает образование микроядер, является маркером генетической нестабильности. Количество клеток с микроядрами зависит от генотипа организма, а сами микроядра могут формироваться при генетической аномалии.

Повреждение хромосом, и формирование микроядер часто наблюдается при новообразованиях, что дает возможность применения микроядерного теста для прогнозирования онкологических заболеваний.

Клетки, содержащие микроядра часто образуются в результате воздействия токсических веществ и влияния физических факторов.

Численность клеток с микроядрами возрастает при воздействии радиации.

Установлен дозозависимый эффект воздействия радиации на образование микроядер.

Поскольку радиоактивное излучение индуцирует появление клеток, содержащих микроядра, то микроядерный тест может быть с успехом использован для контроля эффективности радиопротекторов, особенно в экспериментальной практике.

Соотношение жизнеспособных клеток и клеток, содержащих микроядра,

является важным показателем при цитологических исследованиях.

На основании сказанного представляется возможным сделать ряд обобщений.

Прежде всего, необходимо подчеркнуть особую значимость идентификации клеток с микроядрами для различных областей практической медицины и исследований теоретического и прикладного характера.

Не менее важным представляется вопрос происхождения микроядер. Анализ литературных источников ясно показывает, что формирование крупных микроядер является следствием патологии митотического деления клеток, в процессе которого происходит отставание некоторых хромосом в метафазе и в анафазе. Структурные аберрации хромосом влекут за собой образование мелких микроядер. В то же время при апоптозе могут встречаться микроядра различного размера, что связано с фрагментацией ядра клетки, подверженной этому процессу.

Исходя из этого, не трудно предположить, что крупные микроядра будут образовываться при действии на организм различных мутагенов, а мелкие, в то же время, свидетельствовать о наличии хромосомных аберраций, например при старении организма, и указывать на снижение потенциальной возможности клеток к регенерации и репарации.

48

Регистрация структурно-функциональных изменений, при которых в клетках выявляется наличие микроядер, представляет собой высокоинформативный и вместе с тем простой в техническом отношении метод оценки влияния на организм различного рода факторов.

В заключении следует отметить, что регистрация клеток, имеющих в своем составе микроядра, является практически значимым и высоко информативным диагностическим показателем многих заболеваний, позволяющим с достаточной вероятностью прогнозировать их течение, и дающий возможность осуществлять контроль их коррекции. Экспериментальная практика считается ещѐ одной областью применения микроядерного теста для определения эффективности действия факторов,

используемых с лечебной целью.

Решение фундаментальных вопросов, касающихся образования микроядер,

вероятно, позволит более точно определить место индуцирующих их процессов в возникновении целого ряда заболеваний (Ильин Д.А., 2006 год)

49