Важным преимуществом дрозофилы для генотоксических исследований является возможность исследований мутагенной активности соединений на половых клетках различных стадий. Это имеет большое значение, т.к. одной из характерных черт химических мутагенов является чувствительность к разным стадиям.

Благодаря вышеперечисленным преимуществам дрозофила широко используется в качестве тест-системы для изучения мутагенов окружающей среды.

1.7.3. Allium cepa как тест-объект в генетической токсикологии

Лук севок Allium cepa L. (отдел Angiospermae, класс Liliopsida, подкласс Lilidae,

порядок Liliales, семейство Alliaceae, род Allium L.) в качестве тест объекта широко применяется для оценки генетического потенциала химических соединений,

природных и сточных вод (Sharma, 1983). Лук имеет 16 хорошо прокрашиваемых

одного и того же растения, но усреднѐнные данные являются достаточно устойчивыми.

Продолжительность митоза в разных тканях корня Allium cepa одинакова и не меняется по длине корня. Соотношение различных фаз митоза не зависит от времени фиксации.

Тесты с использованием меристематических тканей проростков корешков лука позволяют регистрировать токсические (прирост корешков), митозмодифицирующие

(нарушение митотической активности меристемы, патология веретена деления) и

мутагенные эффекты (индукции микроядер и хромосомные мутации) (Sharma, 1983).

Меристема корней лука посевного Allium cepa L. сорта Штутгартер-Ризен, была предложена Шведской королевской академией наук как стандартный тест— объект (Constantin M.J., 1982; Geirid Fiskesjö, 1985).

Метод с использованием Allium cepa, или Allium test, рекомендован экспертами ВОЗ (Всемирной организации здравоохранения) как стандарт в цитогенетическом мониторинге окружающей среды, поскольку результаты, полученные на нем,

показывают корреляцию с тестами на других организмах: водорослях, растениях,

насекомых, а также млекопитающих и человеке (Абилев С.К., 1989; Sadyhova N.D., 2008).

Нами была предложена модификация данного метода (Песня Д.С. и

Романовский А.В., 2010). Суть модификации в том, что для анализа генетических повреждений использовались одновременно микроядерный тест и анателофазный анализ. Одновременное использование двух тестов на одном препарате позволяет

39

анализировать всю совокупность делящихся и не делящихся клеток, что повышает

разрешающую способность каждого метода и даѐт более достоверные результаты.

1.7.4. Метод «Allium Test»,

история, преимущества перед другими методами и перспективы

Allium test – в котором в качестве материала используются корешки проростков

репчатого лука Allium cepa. Биотест Allium cepa разработан более 70 лет назад

А. Леваном в 1938 и в том же году использовался для изучения эффекта влияния

колхицина (Levan, 1938; Оstergren, 1944), и получил много внимания

(Арефьев В.А., 1995; Geirid Fiskesjö, 1985).

После А.Левана разработкой биотестирования с помощью лука обыкновенного

занимался шведский ученый Dr. Geirid Fiskesjo в 80-х годах. Вот его собственная оценка данного метода: растения легки для хранения и ухода, широко распространены

инедорогие. Вообще, состояние хромосомы клеток растения – хорошее, поэтому обеспечивает высокое качество в контрольных условиях.

Биотест Allium cepa является относительно быстрым, легким для выполнения испытаний, а также высокочувствительным и воспроизводимым. Это также обеспечивает схожие результаты с целым рядом других тестовых систем.

Как макроскопический, так и микроскопический эффекты, обладают хорошей корреляцией между собой. Макроскопический эффект (сдерживание корневого прироста) является самым чувствительным параметром. Сдерживание прироста является следствием прямых или косвенных вредных эффектов. Микроскопическое исследование позволяет оценить повреждения хромосом и нарушения деления клеток,

ипоэтому обеспечивает дополнительную информацию относительно остроты,

механизма генотоксического эффекта или потенциальной мутагенности.

Корневые клетки обладают определенными энзимами, выполняющими функции оксидаз, которые способствуют превращению многих не мутагенных веществ в мутагенные. Эта система активации позволяет обнаружить те химические вещества,

которые усиливают свой токсический эффект в процессе метаболизма.

Биотест может также использоваться для измерения относительной токсичности нерастворимых в воде соединений, при условии, что они могут быть растворены в подходящем растворителе, а затем разбавлены в воде таким образом, что остаточная концентрация не превысит определенных пределов. В таких случаях для контроля растворителей должен также быть организован тестовый режим. Биотест действует в широких пределах pH (3.5-11.0) без каких-нибудь очевидных эффектов на приросте корневых систем. Поэтому умеренно кислые/щелочные образцы воды, химические

40

растворы, и т.п. могут быть исследованы без необходимой корректировки pH. Хотя pH

непосредственно не воздействует на прирост корней, но это нужно принять во внимание при оценке токсичности растворов, так как, во многих случаях, pH может значительно изменять их токсический потенциал, например, изменяя состояние ионизации.

В сравнении с другими краткосрочным альтернативным биотестами на токсичность этот тест показал хорошую сходимость с результатами других тестовых систем.

Испытания, проведенные на человеческих лимфоцитах, которые оказались немного более чувствительными к эффектам органических ртутных соединений, чем клетки меристемы корней Allium cepa, показали, что общая классификация химической токсичности подобна. Нужно также отметить, что изучение микроскопических параметров обоих групп клеток дают подобный эффект (c-митоз).

Биотестирование с помощью Allium сера, в данном случае, является лучшим методом определения экологического риска за счет его высокой чувствительности.

Другие животные (например. Nitocra spinipes) и растения (напр. морские водоросли и одноклеточные) представляют сопоставимые результаты рассматриваемому биотесту

(Geirid Fiskesjö, 1985)

1.7.5. Преимущества растительных тест систем

Растительные тест-системы в настоящее время получают всѐ большее распространение при оценке мутагенного загрязнения окружающей среды. Это обусловлено целым рядом преимуществ растений как индикаторов генотоксичности различных факторов, так и сигнальных объектов при генетическом мониторинге за состоянием окружающей среды:

Растения – неизменный объект для натурных исследований антропогенного влияния на окружающую среду: первыми принимают на себя удар загрязнителей, не мигрируют подобно животным, что позволяет чѐтко рассчитать время воздействия.

1.Растения – эукариотические организмы, поэтому на них, в отличие от микроорганизмов, можно регистрировать все типы генетических повреждений:

генные, хромосомные и геномные.

2.Методы работы с растительными объектами экономичны, требуют минимального количества оборудования и реактивов, выращивание растений менее трудоѐмко, чем работа с животными.

3.Можно получать материал нужных стадий.

41

4.Эксперименты можно вести в строго контролируемых условиях – как в острых, так и

вхронических опытах (от нескольких часов до нескольких лет).

5.Данные по мутагенезу ряда факторов на растительных объектах показывают хорошую корреляцию с результатами тестирования на животных.

6.Растения позволяют регистрировать как прямые, так и косвенные мутагены.

7.Только растения позволяют выявить такой важный класс мутагенов, как химические соединения, приобретающие мутагенность в процессе метаболической активации растительными ферментами.

8.Некоторые факторы, высокая токсичность которых не позволяет учесть генетические повреждения на животных, могут быть оценены как мутагены только в растительных тест-системах.

9.Растения могут выращиваться непосредственно на месте оценки суммарного

генетического эффекта загрязнения определяемых участков (Прохорова, 1988).

Наиболее часто применяется анализ частоты хромосомных аберраций в ана-

телофазе митоза (анателофазный тест). В этом тесте регистрируются хромосомные мутации типа делеций и транслокаций, а также нарушения веретена деления по частоте отставания хромосом, многополюсных и ассиметричных митозов. Анателофазный метод с использованием лука в качестве тест объекта рекомендован в качестве тест объекта природных сред. При сравнении мутагенной активности химических загрязнителей, определѐнных в других токсикогенетических тестах с ана-телофазным методом установлено, что чувствительность его высока и составляет 82%.

Однако учѐт только хромосомных аберраций может привести к занижению реального генотоксического эффекта, например, по следующим причинам. Во-первых,

эти методы не позволяют регистрировать генные мутации, которые возникают значительно чаще хромосомных. Во вторых, хромосомные мутации выявляются, как правило на фоне высокой митотической активности меристематических клеток.

Повышенная токсичность факторов среды может вызывать снижение количества делящихся клеток за счѐт задержки клеточного цикла в точках контроля, либо гибели части клеток, а значит при этом искусственно снизится и частота регистрируемых хромосомных повреждений.

Точки контроля клеточного цикла (checkpoints) представляют собой периоды цикла, где происходит проверка точности выполнения предыдущей стадии. Такой механизм предохраняет делящиеся клетки от летального митоза, останавливая деление и давая время системе репарации для восстановления повреждений ДНК. Когда контролирующий механизм обнаруживает повреждѐнную или не реплицированную

42