и поляризацией собственных молекулярных колебаний воды (Петросян В.И., 2005).

Предполагается, что в процессе синхронизации молекулярных колебаний происходит диссоциация молекул воды на ионы Н+ и ОН-, что может привести к появлению РФК

(Иголкина Ю.В., 2009), а следовательно реализации цепочки вышеупомянутых событий. УВЧ-обработка воды сопровождается процессами конденсации электронов в воде с образованием ион–радикалов, которые под действием поля быстро трансформируются в свободные радикалы. Облученная вода дополнительно защелачивается вследствие накопления гидроксил–ион–радикалов.

1.7.Методы исследования

1.7.1.Тест-системы для оценки мутагенов

Необходимость обеспечения генетической безопасности человека заставляет искать простые и надежные тесты для выявления возможных последствий изменения окружающей среды, проверки генетической активности многих химических веществ,

используемых в сельском хозяйстве, промышленности, медицине, при приготовлении и консервировании пищи. Для определения генетической и, прежде всего, мутагенной активности различных химических веществ и загрязнителей окружающей среды используется целый ряд тестов. Для выявления и оценки мутагенности, как отдельных факторов, так и суммарной мутагенной активности различных сред в настоящее время разработано много методов с использованием самых различных тест-объектов: от бактерии до человека (Дубинин, 1989). Каждый класс соединений имеет высокую специфичность в отношении индукций генетических событий, начиная от точковых мутаций и кончая хромосомными и геномными мутациями. Кроме того, каждое из обнаруживаемых генетических изменений может иметь различные молекулярные механизмы, что требует хорошего подбора соответсвующих тест-систем (Пашин Ю.В.,

др., 1983). Согласно термину под тест-объектами понимаются живые организмы,

помещенные в исследуемую среду и по выживаемости, состоянию и поведению которых судят о качестве среды, факторах, действующих самостоятельно или в сочетании с другими (Евгеньев М.И., 1999).

Необходима проверка всех факторов, с которыми сталкивался человек, на генетическую безопасность, т.е. способны ли эти факторы повреждать ДНК. Эта работа

внастоящее время нереальна по следующим причинам:

слишком много факторов, которые нужно проверить;

35

есть мутагены универсальные, которые повреждают ДНК у всех организмов (от вирусов до человека), и есть специфические, которые вызывают мутации только у определѐнных видов.

Б.Бриджесом и Фламмов была предложена этапность тестирования, когда на первом этапе факторы отбираются по степени индуцируемого генотоксического эффекта. Традиционно процедура тестирования делиться на три этапа:

Этап 1. Первичный скрининг. Задача выявить может ли в принципе данный фактор взаимодействовать с ДНК. Требования к методам этого этапа: высокая чувствительность, краткосрочность и экономичность. На данном этапе в качестве тест-объектов используются культуры клеток млекопитающих и человека.

Этап 2. Определение, может ли данный фактор повреждать ДНК эукариот в эукариотических клетках. В качестве тест-объектов используются культуры клеток млекопитающих и человека.

Этап 3. Выяснение, может ли данный фактор вызывать генетические нарушения в целостном организме. Используются тесты, учитывающие эффект в соматических и половых клетках in vivo (Прохорова И.М., 2005).

Расширение набора тестов повышает точность первичного выявления мутагенов

(Фонштейн и др., 1977). Широкий набор тестов повышает прогностические

возможности метода и снижает вероятность ложно-позитивных и ложно-негативных результатов. Сочетание тестов подбирается в зависимости от класса фактора, области его применения, задач работы, условий лаборатории и т.д. В современной

токсикогенетике широко используются в качестве тест-объектов: бактерии

(Salmonella typhimurium и Е. coli); грибы (Saccharomyces cerevisae, Aspergillus nidulans и

Идеальный токсико-генетический метод должен отвечать следующим требованиям:

1.Быть высоко чувствительным, чтоб не пропустить потенциальный мутаген, не дать ложноотрицательного ответа;

2.Быть специфичным, чтоб регистрировать только истинные мутагены и не давать ложноположительного результата;

36

3.Регистрировать все типы мутаций: генные, хромосомные и геномные;

4.Выявлять как мутагены, так и промутагены, т.е. вещества, не обладающие ДНК-

повреждающим действием, а приобретающие мутагенность в процессе метаболизма;

5.Регистрировать как универсальные мутагены, индуцирующие мутации у всех организмов, так и специфичные, действующие на ограниченное число биологических систем;

6.Быть экономичным, т.е. быстрым, простым, доступным в выполнении;

7.Давать устойчивые, воспроизводимые результаты;

8.Обнаруживать эффекты даже малых доз мутагенов;

9.Позволять экстраполировать результаты на человека в плане качественной оценки

генетического риска.

Для выявления промутагенов надо изучать не только сам фактор

«химическое соединение», но и его метаболиты в организме. В системах с метаболической активацией промутагенов используют микросомную фракцию печени,

кровь или мочу животных и человека. А также экстракты из тканей высших растений

(Прохорова И.М., 1991).

Конечной целью работы с любой тест-системой является оценка риска влияния мутагенов биосферы на зародышевые клетки человека и на генетический аппарат в соматических тканях. В первой случае оценивается увеличение генетического груза для последующих поколений человечества, во втором – появление злокачественного роста,

ускорение жизни и других нарушений в организме людей, подвергавшихся воздействию мутагена (Дубинин, 1977).

Для выяснения количественного влияния мутагенов среды на наследственный аппарат человека необходимо прямое изучение мутаций в зародышевых и соматических клетках организма человека.

Установление мутагенности вещества является всего лишь перовой ступенью при оценке его возможного влияния на организм человека. Необходимо знать широту распространения данного соединения в среде, окружающей людей, время переживания мутагена, метаболические пути превращения в организме человека, генетически значимые концентрации и индивидуальные реакции на низ разных людей

(Дубинин, 1977).

1.7.2. Drosophila melanogaster как тест-объект в генетической токсикологии

Дрозофила, иначе плодовая или уксусная муха, принадлежит к семейству

Drosophilidae из отряда Diptera. Это очень маленькая, около 2-3 мм, мушка, грудь

37

желтая или буровато-желтая, передние лапки самцов с гребешками, представляющих собой ряд крепких хитиновых щетинок на первом членике лапки; брюшко желтое с более или менее широкими перевязями по заднему краю тергитов, вершина брюшка у самцов черная. Самки несколько крупнее самцов (Ватти, Тихомирова, 1979).

Ее родиной считают Индо-Малайскую область. В настоящее время почти космополит.

В лабораторных опытах Drosophila melanogaster впервые была использована Корпентером в самом начале ХХ века. На ней изучали влияние родственных скрещиваний, условий содержания и т.д. (Медведев Н.Н., 1968).

Сегодня Drosophila melanogaster является одним из основных модельных объектов генетики высших организмов. Этот объект имеет ряд достоинств.

Геном Drosophila melanogaster был полностью секвенирован (Adams М.D., 2000). Около 75% генов ответственных за болезни у человека, обнаруживают гомологию в геноме дрозофилы (Reiter L.T., 2001). Основные биохимические процессы в клетках насекомых и млекопитающих идентичны (Panagopoulos D.J., 2010). Плодовая мушка легко разводится в лабораторных условиях; пара особей в отдельной пробирке дает десятки потомков (рис. 6 ниже). При 25°С длительность развития поколения составляет 10 суток. Ее клетки содержат 4 пары хромосом. Характерно исключительное богатство мутационных рас, большинство из которых характеризуется четким фентотипическим проявлением.

Рис. 6 Цикл развития дрозофилы

38