книги из ГПНТБ / Технология гидролизных производств учебник

6. ОСНОВЫ СИСТЕМАТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Систематика — наука о классификации организмов и опознава­ нии установленных групп. Систематика микроорганизмов должна отражать процесс их эволюции.

Составить правильную систематику микроорганизмов, а также определить положение их в системе живых организмов было воз­ можно только после того, как был найден метод получения чистых культур микроорганизмов, т. е. культур, полученных из одной клетки. Этот метод разработан Р. Кохом, предложившим для по­ лучения чистых культур применять твердые среды. Для приготов­ ления этих сред он впервые применил желатин. На твердых сте­ рильных средах новые молодые клетки, не отделяясь друг от друга, образуют колонии, содержащие микроорганизмы только од­ ного вида, так как колонии получены из одной клетки. Чистые культуры микроорганизмов пригодны для изучения. Метод чистых культур дал возможность-определить признаки микроорганизмов и, следовательно, с достаточной степенью точности установить их виды. Систематизируют микроорганизмы таким образом, как они развивались в природе, т. е. от более простых к более сложным.

При составлении систематики микроорганизмов используются следующие признаки: 1 ) морфологические (форма и величина кле­ ток, характер колоний и штриха, окраска и др.); 2 ) физиологи­

ческие— различия в обмене веществ, характер продуктов обмена, сбраживаемость сахаров, отношение микробов к различным источ­ никам питания, способы получения энергии; 3) культуральные — характер роста на различных субстратах; 4) филогенетические

в составе веществ микробных клеток (химический состав клеточ­ ных оболочек, цитоплазмы, нуклеиновых кислот). А. Н. Белозер­ ский и А. С. Спирин установили, что ДНК обладает видовой спе­ цифичностью. Они считают, что каждому виду микробов присуща своя ДНК, характеризующаяся определенным составом нуклеоти­ дов. Состав последних различен у разных микробных видов.

Так как основой наследственности и специфики организмов яв­ ляются белки и нуклеиновые кислоты, то состав их будет опреде­ лять видовые признаки микроорганизмов. Таким образом, био­ химический подход к систематике микроорганизмов является пер­ спективным.

Основная единица в систематике — вид. Виды — биологически обособленные группы микроорганизмов. Каждому виду присуща качественная определенность, которая проявляется в морфологи­ ческих, физиологических и биохимических особенностях, в функ­ циях, в образе жизнедеятельности и взаимоотношениях между осо­ бями вида.

Основной метод для определения видовой принадлежности дрожжевых организмов — выращивание их на разных специальных

180

средах. В этом случае определяют: 1) характер роста и развития на твердых и жидких средах; 2 ) способность образовывать споры

на среде Городковой; 3) характер усвоения углеводов путем выра­ щивания на дрожжевой водес2 %-ными растворами различных са­

харов— глюкозой, сахарозой, лактозой и др.; 4) характер фермен­

Таким образом, вид определяется суммой разнообразных при­ знаков и свойств. Вид состоит из штаммов и разновидностей. Штамм — мельчайшая систематическая единица, отражающая ма­ лейшие отклонения от типового представителя вида.

Бактерии обычно относят к простейшим растительным организ­ мам. Многие признаки сближают их с низшими водорослями и грибами, некоторые стоят ближе к низшим животным. Системати­ зировать бактерии довольно сложно, так как клетки имеют незна­ чительные размеры и однообразную форму. Одной общепринятой систематики бактерий в настоящее время нет. Они отличаются друг от друга свойствами и признаками, которые используют для установления видов, родов, семейств и т. д. Наиболее широко при­ меняется систематика бактерий Н. А. Красильникова. Он делит все бактерии на четыре класса. Каждый из классов, по его мне­ нию, представляет собой как бы отдельный этап эволюционного развития этих организмов: I — актиномицеты (Actinomycetes); II — собственно бактерии (Bacteriae); III — миксобактерии (Мухоbacteriae); IV — спирохеты (Spirochaetae).

Каждый класс делится на семейства, роды, виды. Существует система Лемана и Неймана, система Бердже, составленная аме­ риканскими бактериологами.

Систематика грибов. Грибы относятся к низшим бесхлорофиль-

ным растениям. Определенная группа из них ближе к низшим жи­ вотным. В основу их систематики положены различные морфоло­ гические, физиологические и биохимические признаки. Грибы де­

доросли, имеющие не разделенный на клетки, разветвленный ми­ целий, размножаются спорами. К ним относятся мукоровые грибы.

III — аскомицеты (Ascomycetes)— спорообразующие микроорга­ низмы, или сумчатые грибы, у которых споры образуются в спе­ циальных вместилищах — сумках (асках). Кроме аскоспор, раз­ множаются конидиями — округлыми тельцами, образующимися на концах гиф. Аскомицеты имеют разнообразное строение, форму, сумки у них располагаются по-разному. Класс аскомицетов де­ лится на два подкласса: 1) простейшие аскомицеты (Protoascomycetes), у которых сумки развиваются на мицелии, плодового тела нет, и 2 ) высшие аскомицеты (Euascomycetes) — сумки у них

181

располагаются группами внутри или на поверхности плодовых тел,

образования сумок и типом мицелия. Порядок первичносумчатых делится на семейства. Они отличаются признаками, которые ис­ следователи кладут в основу деления. Так, Гильермон микроорга­ низмы этого порядка разделил на два семейства в зависимости от местоположения сумок: а) сахаромицеты (Saccharomycetaceae)— немицелиальные грибы, у них сумки развиваются внутри отдельных клеток; сюда относятся дрожжи, классификация которых будет приведена ниже, и б) мицелиальные грибы (Endomycetaceae), у которых сумки образуются на концах мицелиальных нитей. В зависимости от способа образования и прора­ стания спор, а также их формы семейства делятся на роды. На основании различных морфологических, физиологических и биохи­ мических признаков роды подразделяются на виды.

В подкласс высших аскомицетов входит несколько порядков. К порядку сложносумчатых грибов (Plectoascales) относятся плес­ невые грибы, имеющие мицелий, образующий воздушные нити — конидиеносцы, на которых находятся конидии. Этот порядок де­ лится на семейства; в их число входят семейство кистевидных плесней (Aspergillaceae), к которому относятся два рода: а) аспергиллус (Aspergillus), особенностью его является то, что на кон­ цах гиф-конидиеносцев имеются образования различной формы, на них вырастают особые клетки стеригмы, от которых отделяются конидии; б) пенициллиум (Penicillium) — кистевидные плесени, ко­ нидиеносцы, разветвляясь, дают несколько побегов, на которых на­ ходятся стеригмы с конидиями. В зависимости от количества по­ бегов, от формы образования у аспергиллусов, от окраски конидий роды делятся на виды.

IV. Базидиомицеты (Basidiomycetes)— базидиальные грибы, на­ иболее высокоорганизованные, имеющие многоклеточный мицелий и плодовые тела. Размножаются в основном половым путем; споры образуются на спороносцах (базидиях).

V. Несовершенные грибы (Fungi imperfecti) — характерной осо­ бенностью их является то, что они не образуют аскоспоры. По мне­ нию В. И. Кудрявцева и Н. П. Блинова, этого признака недоста­ точно, чтобы данные микроорганизмы могли быть отнесены к не­ совершенным грибам, так как по всей структуре и многим свойствам (отношению к источникам углеродистого питания, спо­ собностью к почкованию) они близко подходят к спорообразую­ щим дрожжевым организмам аскомицетам. Некоторые виды дрож­ жеподобных грибов являются несовершенными стадиями развития спорообразующих дрожжевых организмов.

К классу несовершенных грибов относятся дрожжеподобные грибы — торулопсис, кандида, монилия и др. Краткая системати­ ка их приведена ниже (см. стр. 2 2 2 ).

182

Глава VIII

БИОХИМИЯ В ГИДРОЛИЗНЫХ ПРОИЗВОДСТВАХ

1. ФЕРМЕНТЫ МИКРООРГАНИЗМОВ

Ферментами, или энзимами, называются специфические белко­ вые вещества с высокой молекулярной массой, входящие в состав клеток и тканей живых организмов и значительно ускоряющие био­ химические реакции. Поэтому они называются биологическими катализаторами. Живая клетка не может существовать без фер­ ментов. Ферменты определяют течение, скорость и последователь­ ность биохимических процессов в живых микроорганизмах, а сле­ довательно, и весь обмен веществ. Свойственный данному организму характер обмена веществ определяется его генетической при­ родой, от которой зависит специфический для него набор ферментов и соотношение скоростей отдельных ферментативных процессов, неразрывно связанных между собой. Ферменты вырабатываются живыми клетками, но осуществлять свое действие они могут и вне клеток.

Ферменты были открыты в начале XIX в. Русский исследова­ тель К. С. Кирхгоф в 1814 г. обнаружил, что под действием

В настоящее время известно свыше 875 ферментов, которые ускоряют многочисленные реакции в живых организмах, в част­ ности в микроорганизмах.

Свойства ферментов. 1. Ферменты обеспечивают протекание

различных реакций с достаточной скоростью в обычных условиях давлений и температур или при слабоповышенной температуре (оптимальная температура 30—40° С) и прекращают свое дей­ ствие при кипячении. При охлаждении эта способность не вос­ станавливается. С помощью химических катализаторов такие реакции можно проводить лишь при высоких температурах и давлениях.

Ферменты термофильных микроорганизмов сохраняют свою природу и активность при повышенных температурах.

Низкие температуры не влияют отрицательно на ферменты; при температурах ниже нуля они не проявляют никакой деятель­ ности, но и не инактивируются.

2. Действие ферментов избирательно и специфично. Высокая специфичность — одно из замечательных свойств ферментов. Она связана со структурными особенностями самого фермента и суб­ страта. Под специфичностью подразумевают способность фермента

183

только одного определенного химического соединения и неактивен даже по отношению к родственным соединениям. Например, уреаза расщепляет только мочевину; б) абсолютная групповая специфичность — ферменты действуют на группу близких друг другу химических веществ, имеющих общий тип строения, причем имеет значение не только определенный тип связи, но и опреде­ ленная структура прилегающего к ней радикала. Так, мальтаза катализирует гидролиз не только мальтозы, но и других субстра­ тов, имеющих а-глюкозидную связь, образованную глюкозидным гидроксилом а-глюкозы и гидроксилом другой монозы; в) относи­ тельная групповая специфичность — фермент специфичен только в отношении связи, которой соединены части молекулы, и безраз­ личен к химической структуре самой молекулы. Эстеразы, на­ пример, катализируют расщепление не только триглицеридов, но

в очень малых количествах по сравнению с большим количеством веществ, на которЬіе они действуют. Так, 1 г фермента амдлазы при определенных условиях может превратить в сахар тонну крахмала.

их не бесконечно. Тормозящим фактором является накопление больших количеств конечных продуктов ферментативной реакции. После удаления последних каталитическое действие фермента восстанавливается.

5. Ферменты способны с высокой эффективностью катализиро­ вать биохимические реакции, но не могут вызывать их и изменять направление.

6 . Концентрация водородных ионов, или активная кислотность

среды, играет большую роль при действии ферментов. Для каждого фермента есть свое оптимальное значение pH, при кото­ ром каталитическая активность проявляется наиболее полно. Так, для амилазы pH равно 5,2; для мальтазы — 6 ,6 ; для сахаразы —

4,6.

7. Ферменты растворяются в воде, в водных растворах ней­ тральных солей, в глицерине; осаждаются спиртом, ацетоном.

8 . Ферменты катализируют многообразные по своему химизму

реакции, идущие в прямом и обратном направлении, например реакции гидролиза, синтеза, окислительно-восстановительные, конденсации, изомеризации.

9. Под влиянием различных факторов внешней среды соотно­ шение ферментов в микроорганизме может измениться, могут

превышает активность химических, так как ферменты значительно сильнее понижают энергию активации, чем неорганические

184

катализаторы. Они различаются также по степени специфичности

иизбирательности действия.

Химическая природа ферментов. Ферменты по своей химической

природе делятся на две группы: 1) однокомпонентные ферменты — протеины, представляющие собой простые белки; к ним относится большинство гидролитических ферментов; ферментативная актив­

комплекс, состоящий из собственно фермента и связанного с ним кофермента.

Кофермент — это термостабильное органическое соединение не­ белковой природы, необходимое для действия фермента. Кофер­ менты сравнительно легко удаляются через полупроницаемую перегородку при диализе. Коферменты, которые сравнительно прочно связаны с ферментами, называют простетической (от греч. prosthesis— дополнение) или активной группой.

В результате изучения химической природы коферментов выяснилось, что многие из них являются витаминами или произ­ водными витаминов. Ряд ферментов в качестве кофермента со­ держат биотин. Это очень важный кофермент, который входит в состав ферментов, катализирующих реакции карбоксилирования и декарбоксилирования. Кофермент, участвующий в синтезе нуклеиновых оснований и переносе одноуглеродных радикалов, содержит витамин В12- Один и тот же кофермент, например

никотинамиддинуклеотид, соединяясь с различными белками, образует самые разнообразные ферменты, различающиеся по ха­ рактеру катализируемых ими реакций.

Вторым компонентом оказалась термолабильная часть, имею­ щая специфическую белковую природу и получившая название коллоидного носителя. Белковую часть двухкомпонентного фермента называют также апоферментом.

Белковая часть фермента обусловливает его специфичность, т. е. возможность его воздействия на определенные вещества, так как установлено, что специфичность ферментов зависит прежде всего от порядка чередования аминокислот в белковой молекуле фермента. Небелковая часть — кофермент определяет каталитиче­ скую способность фермента. Но это разграничение условно; каталитическая активность фермента и его специфичность пред­ ставляют собой единство.

В катализе принимает участие как кофермент, так и некоторые группы коллоидного носителя, входящие в активный центр фер­ мента.

К группе двухкомпонентных ферментов принадлежат в основ­ ном ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные процессы.

Механизм ферментативного катализа. В настоящее время суще­

ствует ряд теорий, объясняющих механизм действия ферментов. Большинство исследователей считают, что ферменты вступают в промежуточное соединение с субстратом, на который они

185

каталитически действуют. При этом образуется нестойкое и лабильное соединение фермент-субстратный комплекс. Связи, участвующие в образовании этого соединения, разнообразны и

в субстрате имеются заряженные группы, образование соединения фермент-субстратный комплекс происходит благодаря электро­ статическому взаимодействию и возникновению ионных связей между отрицательно заряженными группами субстрата и положи­ тельно заряженными группами фермента и, наоборот, между положительно заряженными группами субстрата и отрицательно заряженными группами фермента. Если субстрат не содержит заряженных групп, что имеет место, например, в случае углеводов, то присоединение фермента к субстрату происходит благодаря образованию водородных связей. При воздействии фермента на углеводородные цепи субстрат соединяется с ферментом благо­ даря гидрофобным взаимодействиям.

Механизм каталитического действия разных ферментов раз­ личен, так как он зависит от химической природы кофермента или активной группы.

В основе всех теорий, объясняющих механизм действия фер­ ментов, лежит представление о том, что фермент снижает энергию активации, необходимую для протекания данной химической реакции. Фермент изменяет молекулу субстрата таким образом, что энергия, которую нужно придать этой молекуле для того, чтобы она прореагировала, понижается. Снижение энергии акти­ вации происходит благодаря изменению конфигурации его молекулы.

Под влиянием соединенного с субстратом фермента происходит как бы деформация молекулы. Молекула субстрата поляризуется, электроны перераспределяются в ней, что и приводит к измене­ нию расположения электрических зарядов, т. е. к изменению электронной структуры и ее разрыву.

Особенностью ферментативного катализа является высокая эффективность действия ферментов. В настоящее время установ­ лено, что активность фермента характеризуется не одной хими­ ческой группировкой, а несколькими специфическими группами, расположенными строго определенным образом в молекуле фермента.

Изучение этих функциональных групп привело к представлению об активном центре фермента, т. е. той комбинации различных химических группировок в молекуле фермента, благодаря которой осуществляется его каталитическое действие. Следовательно, часть молекулы фермента, непосредственно участвующая в связы­ вании субстрата и осуществляющая каталитическое действие, на­ зывается активным центром. Химические группировки активного центра обеспечивают специфическое сродство и образование со­ единения фермент-субстратный комплекс. Так, действие ферментов можно представить следующим образом: А + В + Ф АФ+ В+*

186

=<=ьАВ + Ф, где Ф — фермент, А и В — реагирующие вещества. Вначале фермент со вступающим в реакцию веществом образует нестойкое промежуточное соединение фермент-субстратный комп­ лекс (АФ). Затем образовавшееся соединение при каталитическом действии фермента распадается с образованием конечных продук­ тов ферментативной реакции, причем фермент непрерывно регене­ рируется, и количество его с течением времени не изменяется. Следовательно, действие фермента осуществляется благодаря образованию с участием активного центра ооединения ферментсубстратный комплекс и последующем перераспределении элек­ тронов в этом соединении, приводящем к реакциям гид­ ролиза, окисления, восстановления и другим химическим превра­ щениям.

Различные физико-химические данные указывают на то, что образование соединения фермент-субстратный комплекс сопровож­ дается изменением конформации молекулы фермента, а следова­ тельно, и активного центра. Причем эти данные были получены для одно- и двухкомпонентных ферментов.

Для большинства ферментов в настоящее время установлены активные центры-и функциональные группы, однако за каталити­ ческую активность фермента ответственна вся структура его молекулы, а не только активный центр или функциональные группы.

Решающим фактором высокой эффективности и специфичности ферментативного катализа является сложная пространственная структура белковой молекулы, обеспечивающая возможность строго согласованного и направленного воздействия определенных функциональных групп фермента на субстрат и образование со­ единения фермент-субстратный комплекс.

Действие ферментов в живой клетке. Ферменты вырабатыва­

ются цитоплазмой живой клетки, они являются продуктами ее жизнедеятельности и с нею связаны. Каждый микроорганизм вырабатывает особый комплекс разнообразных и многочисленных ферментов, отвечающих его физиологическим особенностям и по­ требностям. Одни ферменты действуют только внутри клетки, прочно связаны со структурой цитоплазмы, в этом случае их на­ зывают внутриклеточными, или зндоферментами. Они катализи­ руют процессы дыхания, брожения и синтеза веществ цитоплазмы. Другие ферменты не связаны со структурой цитоплазмы, могут выделяться живыми клетками во внешнюю среду и там расщеплять сложные вещества субстрата на более простые, до­ ступные для усвоения клеткой. Такие ферменты называются вне­ клеточными, или экзоферментами. Они ускоряют процессы гидролиза. Но резкой границы между этими двумя группами фер­ ментов провести нельзя.

Ферменты подразделяются на конститутивные и индуцируемые. Конститутивные ферменты необходимы для жизни микробных клеток, входят в число обязательных их компонентов и образу­ ются под действием присутствующих в клетках веществ, незави­

187

симо от состава среды. Способность синтезировать тот или иной фермент зависит от наследственной природы данного микроорга­ низма и определяется прежде всего генетическими факторами.

Индуцируемые ферменты синтезируются в клетке лишь в ответ на действие того или иного внешнего фактора и в том случае, когда в среде находится индуктор (например, сахар).

При изучении процессов, происходящих в живой клетке, неяс­ ным оставался вопрос, каким образом в ней находятся в близком соседстве, не взаимодействуя, ферменты и вещества, на которые они могут действовать. По-видимому, в клетке имеется какое-то пространственное разделение ферментов и веществ, поэтому они не взаимодействуют друг с другом. На роль структурной органи­ зации цитоплазмы как важнейшего фактора, от которого зависит действие ферментов в живой клетке, впервые в 1934 г. указал академик А. И. Опарин. По его мнению, ферменты в живых клет­ ках могут адсорбироваться на поверхностях макрогетерогенных систем, например на липопротеидных образованиях цитоплазмы клетки, теряя при этом свою гидролитическую способность. Но при переходе фермента в гомогенный раствор эта способность восстанавливается.

Таким образом, основным фактором, определяющим гидролити­ ческую активность ферментов в живых клетках, является гетеро­ генность клеточной структуры, что обусловливает переход фермента в адсорбированное состояние. В этом случае ферменты не могут осуществлять гидролитические процессы. Подтвержде­ нием правильности этой теории является наличие большого фактического материала. Так, при адсорбции ферментов на активированном угле или других веществах гидролитическая активность .теряется, но это не связано с изменением самих ферментов, а только лишь с переходом их из раствора в осадок. Если такие ферменты перевести опять в раствор, то их гидроли­ тическая способность восстанавливается.

Наряду с процессами гидролиза и распада в живой клетке всегда происходят синтетические процессы. В процессах синтеза сложных органических соединений участвуют те же самые фер­ менты, которые вызывают их распад. Это отвечает требованиям термодинамики, иначе ферменты могли бы смещать химическое равновесие.

По данным А. И. Опарина, синтетическое действие ферментов осуществляется в адсорбированном состоянии, т. е. на структур­ ных поверхностях цитоплазмы. При переходе тех же ферментов в раствор протекают гидролитические реакции. Следовательно, процессы гидролиза и синтеза в клетке пространственно разобщены. Для нахождения благоприятных условий в клетке, при которых ферменты производили бы синтезирующее действие, было применено уравнение Вант-Гоффа, на котором был теорети­ чески обоснован принцип обратимого действия ферментов. По мнению А. И. Опарина, способность к синтезирующему действик> приобретают ферменты, адсорбированные на структурных образо­

188

ваниях клетки, так как в этом случае создается безводная среда, большая концентрация избирательно адсорбированного продукта, а также удаление синтезируемого продукта, т. е. имеются все условия, которые согласно уравнению Вант-Гоффа необходимы для синтеза.

Таким образом, цитоплазма живой клетки регулирует синте­ зирующее или гидролизующее действие ферментов. Большой экспериментальный материал, накопленный в последнее время, свидетельствует о решающей роли субклеточных структур как фактора, от которого зависит действие ферментов. Познание закономерностей действия ферментов в живой клетке дает воз­ можность управлять ферментативными процессами, регулировать и изменять обмен веществ в желательном направлении. Так как для синтетических процессов необходима энергия, то каталитиче­ ское действие ферментов связано с превращением аденозинтрифосфорной кислоты и других соединений, содержащих богатые энергией макроэргические связи.

Выделять ферменты в чистом виде довольно трудно. В настоя­ щее время существует несколько методов выделения ферментов, основанных на осаждении различными органическими раствори­ телями (спирт, ацетон), на экстрагировании их из микроорга­ низмов водой или глицерином, на извлечении путем изменения pH среды под влиянием растворов нейтральных солей (метод высаливания).

Для удаления посторонних примесей, загрязнений и получения чистых ферментов применяют метод диализа и электродиализа, а также иониты, способные избирательно сорбировать ферменты. Особенно хорошим способом разделения ферментов оказалась ионообменная хроматография на колонках из различных ионо­ обменных смол или производных целлюлозы (карбоксиметилцеллюлоза). Для выделения и разделения ферментов применяют также электрофорез. Смысл его заключается в разделении находя­ щихся в растворе веществ в электрическом поле на основе раз­ личий их электрических зарядов.

Для извлечения *ферментов из дрожжей используют процесс автолиза (саморазложения и растворения клеток). Под автолизом понимают сложный процесс разрушения основных составных частей клетки — белков, углеводов, жиров, происходящий под дей­ ствием собственных ферментов клетки. Дрожжевая клетка теряет внутриклеточную воду, нарушается ее тургор. Дрожжи приобре­ тают жидкую консистенцию и погибают. Кислоты, образующиеся при автолизе, нейтрализуются, так как они разрушают фер­ менты. Автолизу подвергаются лишь отмершие или ослабленные клетки.

Активаторы и ингибиторы. Каталитическая активность фермен­

тов, а также скорость ферментативной реакции зависят от специ­ фических активаторов и ингибиторов (парализаторов). Так, дей­ ствие многих ферментов активируется в присутствии незначитель­ ных количеств сульфгидрильных соединений. Существует большая