книги из ГПНТБ / Технология гидролизных производств учебник

группа ферментов, для проявления активности которых необхо­ димо наличие ионов металла. Активаторами многих ферментов являются двухвалентные катионы кальция, магния, марганца, кобальта, а также одновалентные катионы калия, натрия. Например, активность ДНК — полимеразы зависит от присутствия Mg++ или Мп++. Некоторые аденозинтрифосфатазы активируются Na+ и К+. Химические соединения, которые угнетают, задержи­ вают действие ферментов, снижают их активность, получили название ингибиторов. Торможение действия ферментов может быть либо обратимым, либо необратимым. В первом случае после удаления ингибитора фермент восстанавливает свою активность, во втором — нет.

Ингибиторами ферментов являются: соли тяжелых металлов (свинца, ртути, серебра), синильная кислота и ее соли, сернистый водород, фтористый натрий, сильные окислители (хлор, бром). Ингибиторами рибонуклеазы и других ферментов являются неко­ торые металлы, например медь, цинк, бор, действующие на конформацию белка фермента. Сильные ингибиторы — продукты ферментативной реакции. Если удалить их из сферы реакции, то ферменты восстанавливают свою активность.

Угнетение и торможение каталитических функций ферментов основано на связывании ингибиторов с определенными химиче­ скими группировками в активном центре фермента. Так, синиль­ ная кислота является ингибитором ряда окислительных фермен­ тов, содержащих в функциональной группе железо или медь. Соединяясь с этими металлами, синильная кислота блокирует функциональную группу, в результате чего фермент теряет свою активность. Действие на ферменты специфических активаторов и ингибиторов имеет большое значение для регулирования фермен­ тативных процессов, происходящих в микроорганизме, а также при практическом их использовании.

Номенклатура и классификация ферментов. Открываются все

новые ферменты, и случайные названия, которые раньше давались ферментам, стали неудобны. Было принято правило Дюкло — название фермента составлять из корня слова, обозначающего соединение, на которое данный фермент оказывает каталитическое действие, с добавлением к нему суффикса аза (например, фер­ мент, действующий на сахар лактозу, называют лактазой, на сахарозу — сахаразой). Некоторым ферментам давались названия по характеру их действия (дегидратаза). Сохранились и произ­ вольные названия ферментов, например пепсин.

Комиссия Международного биохимического союза по ферментам предложила в 1961 г. новую классификацию и номенклатуру фер­ ментов.

Согласно современным представлениям все ферменты по типу катализируемых ими реакций и по специфичности их действия разделены на шесть главных классов, из которых каждый в свою очередь делится на ряд подклассов, а подклассы — на более

190

мелкие группы. Каждый фермент имеет свой четырехзначный шифр. Первая цифра обозначает класс, вторая подкласс, третья

принятое в настоящее время название фермента, основанное на фактически установленном направлении реакции.

Ниже приведена сокращенная классификация, включающая в основном ферменты, которые чаще всего встречаются у микро­ организмов и имеют для них наиболее важное значение.

1. Оксидоредуктазы — катализируют биологические окисли­ тельно-восстановительные процессы (перенос атомов водорода и электронов), происходящие при брожении и дыхании. Эти фер­ менты имеют особое значение, так как они связаны с реакциями, дающими энергию. Сюда входят дегидрогеназы, которые делятся на две группы: 1) анаэробные дегидрогеназы и 2) аэробные дегидрогеназы.

Анаэробные дегидрогеназы катализируют реакции дегидриро­ вания, переносят водород на те или иные акцепторы. Кофермен­ тами ряда дегидрогеназ являются НАД (никотинамидадениндинуклеотид) и НАДО (никотинамидадениндинуклеотидфосфат), или, по ранее принятой классификации, кодегидраза I и кодегидраза II. Функцией этих коферментов является акцептирование ионов водорода субстрата, активированного дегидрогеназой. При этом коферменты переходят в восстановленную форму.

Аэробные дегидрогеназы передают отнятый от окисляемого субстрата водород кислороду воздуха. Активной группой этих ферментов является ФАД (флавинадениндинуклеотид). Аэроб­ ные дегидрогеназы, для которых акцептором водорода является только кислород, называются оксидазами, ферменты, катализиру­ ющие присоединение кислорода к молекуле субстрата, — оксиге­ назами.

2.Трансферазы (ферменты переноса)— катализируют переме­ щение атомных группировок, или радикалов, от одного соединения

кдругому. Например, фосфотрансфераза (гексокиназа) катали­ зирует перенос остатка фосфорной кислоты во время брожения от аденозинтрифосфата (АТФ) на моносахарид.

3.Гидролазы — катализируют процессы расщепления и синтеза

сложных органических соединений по типу гидролитических реак­

группы: 1) эстеразы, 2) гликозидазы и 3) протеиназы.

Эстеразы катализируют гидролиз сложных эфиров на спирт и кислоту. К ним относятся фосфатазы, расщепляющие сложные эфиры фосфорной кислоты при биологических процессах; липазы, расщепляющие жиры на глицерин и жирные кислоты.

191

Гликозидазы вырабатываются многими микроорганизмами. Они способствуют гидролизу и синтезу различных углеводов и гликозидов по схеме

ROR' + H O H ^RO H + R'OH,

где R и R' представляют собой остатки моно-, диили поли­ сахарида.

К гликозидазам относятся олигазы, действующие на сравни­ тельно небольшие молекулы ди- и трисахаридов, а также гликозидов; из них мы укажем лишь некоторые: сахаразу, расщепляю­ щую сахарозу на .D-глюкозу и D-фруктозу; целлобиазу, расщеп­ ляющую целлобиозу на две молекулы глюкозы; полиазы, катализирующие реакции гидролиза и синтеза высокомолекуляр­ ных полисахаридов (например целлюлаза расщепляет целлюлозу на дисахарид целлобиозу; амилаза — крахмал до мальтозы и декстринов).

Протеиназы (пептидгидролазы) катализируют реакцию гидро­ лиза белков и полипептидов. Гидролитическим путем расщепляют пептидные связи — СО — NH — .

4. Лиазы — ферменты этого класса катализируют реакции не­ гидролитического отщепления каких-либо групп от субстратов (под действием карбоксилазы происходит отщепление углекислого газа от пировиноградной кислоты) или реакции расщепления органических веществ и разрыв связи между углеродными атомами молекул (альдолаза катализирует разрыв шестиуглерод­ ной цепочки гексозы на две молекулы триозы). К лиазам относятся в основном все ферменты брожения, расщепляющие углеводы на более простые соединения.

5. Изомеразы — к этому классу относятся ферменты, катали­ зирующие внутримолекулярные превращения органических соеди­ нений в их изомеры. К ним относится, например, фермент триозофосфатизомераза, катализирующий изомеризацию 3-фосфогли-

двух молекул, которые протекают одновременно с ращеплением АТФ. Энергия, освобождаемая при этом, используется для синтеза компонентов микробной клетки. В результате реакции образуются новые связи: — С — О —; — С — S — ; — С — N — и — С — С —.

К лигазам относится группа ферментов, катализирующих при­ соединение остатков аминокислот к транспортной РНК.

2. ДЫХАНИЕ И БРОЖЕНИЕ

Дыхание и питание являются основными процессами обмена

а также для синтеза различных органических соединений входя­ щих в состав их клеток, необходима энергия. Процессы дыхания

192

являются источником энергии для микроорганизмов. Дыханием или аэробным дыханием называется процесс окисления сложных органических соединений до простых конечных продуктов типа С 02 и Н20 с одновременным выделением свободной энергии.

Русский ученый В. О. Таусон показал, что для многих реакций синтеза, происходящих в цитоплазме живых микроорганизмов, дыхательный процесс как источник энергии не нужен. Выделение углекислоты в ряде процессов также не связано с поглощением кислорода и с полным окислением питательных веществ, т. е. с процессом аэробного дыхания, а происходит в результате про­ цесса, получившего название анаэробного дыхания, или брожения.

Таким образом, в основе дыхания и брожения лежат окисли­ тельно-восстановительные реакции, за счет которых микробные клетки получают энергию, необходимую для процессов их жизне­ деятельности. Часть энергии, выделяющейся при этих процессах, передается макроэргическим фосфатным связям аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), где она и аккумулируется. Разрыв этих связей в свою очередь сопровождается освобождением зна­ чительного количества энергии, которая используется микроорга­ низмами для покрытия энергетических затрат во всех жизненных процессах и прежде всего для биосинтеза важных органических соединений.

В зависимости от отношения к молекулярному кислороду все микроорганизмы делятся на две группы: 1) анаэробные — для жизнедеятельности которых не нужен кислород, и 2) аэробные — хорошо развиваются при свободном доступе кислорода воздуха.

Существует промежуточная группа — микроаэрофильных орга­ низмов, для жизнедеятельности которых требуются незначитель­

могут развиваться только в отсутствии молекулярного кислорода, являющегося для них ядом. К ним относятся маслянокислые бактерии. Факультативные (условные) анаэробы развиваются как в присутствии, так и в отсутствии молекулярного кислорода. К группе факультативных анаэробных микроорганизмов от­ носятся дрожжи.

К аэробным микроорганизмам относятся дрожжеподобные грибы.

Взависимости от потребности в кислороде, способа накопления

иусвоения энергии у микроорганизмов может быть два типа дыхания: анаэробное дыхание (или брожение) и аэробное (или настоящее дыхание). Тип дыхания микроорганизмов зависит также от наличия в микробной клетке тех или иных «дыхатель­ ных» ферментов.

Анаэробное дыхание (брожение). У микроорганизмов при

анаэробном дыхании происходят различные биохимические окислительные процессы превращения органических веществ,

идущие без участия кислорода воздуха и основанные на реакции дегидрирования. Акцептором водорода могут быть промежуточ­ ные продукты процесса окисления субстрата (например, органи­ ческие молекулы, имеющие ненасыщенные связи). Процесс ана­ эробного дыхания происходит следующим образом:

окисляемый субстрат—Н2+ фермент дегидрогеназа —►окисленный субстрат-|-

+дегидрогеназа—Н2; дегидрогеназа—Н2 + акцептор водорода —-дегидрогеназа+

+акцептор—Н2.

При таком окислении выделяется определенное количество энергии, которое используется в процессах жизнедеятельности анаэробных микроорганизмов. Для окисления органических со­ единений анаэробные микроорганизмы не могут использовать молекулярный кислород, так как у них дыхательными ферментами являются только дегидрогеназы, а для использования кислорода необходимы и другие ферменты, например каталаза, которая раз­ лагала бы перекись водорода, образующуюся в процессах дыха­ ния и являющуюся ядом для микробов, и пероксидаза, которая вовлекала бы перекись водорода в окислительный процесс. У ана­ эробных микроорганизмов нет и цитохромов — окислительно-вос­ становительных ферментов, участвующих в переносе водорода.

Таким образом, процессы разложения сложных органических соединений до более простых, происходящие без участия молеку­ лярного кислорода и вызываемые анаэробными микроорга­ низмами, называются брожением; они сопровождаются выделе­ нием сравнительно небольшого количества энергии, необходимой для нужд микроорганизмов. Примером процесса брожения явля­ ется уравнение распада сахара на этиловый спирт и углекислоту

С6Н120 6=2С2Н50Н-ф-2С02-(-56 ккал.

Анаэробные микроорганизмы, являющиеся возбудителями бро­ жения, были открыты Л. Пастером. До него считали, что жизнен­ ные процессы не могут происходить без кислорода и окислитель­ ного дыхания. В настоящее время общепризнано, что источником энергии для микроорганизмов являются разнообразные процессы, происходящие с участием кислорода и без него.

Факультативным анаэробным микроорганизмам свойственно и анаэробное и аэробное дыхание, но последнее выражено слабее. В своих клетках они содержат, кроме дегидрогеназ, еще оксиге­ назы и ферменты, активирующие кислород, т. е. ферменты, свойственные и аэробным микроорганизмам.

Аэробное дыхание. В процессе дыхания аэробные микроорга­

низмы окисляют органические вещества с образованием угле­ кислого газа и воды. Дыхание сопровождается выделением энергии, в этом заключается его физиологическое значение. В качестве энергетического материала для дыхания используются углеводы, белки, жиры/углеводороды, спирты, кислоты и другие

194

органические соединения. Уравнение окисления сахара имеет следующий вид:

С6Н120 6+ 6 0 2 — 6С02+ 6 Н 20 + 6 8 6 шал.

При этом выделяется 686 ккал тепла, что соответствует запасу потенциальной энергии, которая была аккумулирована в молекуле углевода при его фотосинтезе. Аэробные микроорганизмы исполь­ зуют всю содержащуюся в органических соединениях потенциаль­ ную энергию. В случае неполного их окисления энергии выделя­ ется меньше. Часть потенциальной энергии остается в продуктах неполного окисления.

В процессе аэробного дыхания принимают участие различные ферменты типа анаэробных и аэробных дегидрогеназ, поэтому он является более сложным. Аэробные микробы очень разнообразны, поэтому и типов аэробного дыхания много, причем отличаются они друг от друга ферментами, катализирующими процессы окисления субстрата.

Простейший механизм аэробного дыхания представляется в следующем виде. Молекулярный кислород, потребляемый в про­

к кислороду через ряд промежуточных реакций, проходящих по­ следовательно, с участием переносчиков и ферментов; образую­ щаяся перекись водорода ферментом каталазой расщепляется до молекулярного кислорода и воды, освобождая клетку от накопле­ ния этого ядовитого вещества, или при помощи пероксидазы направляется на окисление специфического субстрата.

По теории О. Варбурга, активирование кислорода в процессах окисления происходит при помощи железа, входящего в состав дыхательного фермента (цитохрома). В цитоплазме аэробных микроорганизмов есть и другие ферменты переносчики кислорода, например оксигеназы.

В. И. Палладии впервые показал, что между аэробным и ана­ эробным окислением принципиальной разницы не существует. Аэробным дыханием является процесс окисления, когда акцепто­ ром водорода служит кислород. Анаэробным называют дыхание, при котором акцептором водорода может быть любое вещество,

По теории В. И. Палладина, дыхание микробов происходит под влиянием дегидрогеназ, осуществляющих перенос активирован­ ного водорода с окисляемого вещества (донатора водорода) на акцептор водорода. Акцептором водорода может быть кислород воздуха и органические вещества, способные окисляться и вос­

электрона (Fe+++ + e-^ F e++). В. И. Палладии подчеркивал значение

активирования водорода окисляемого вещества и роль фермен­ тов в процессе активации.

Следовательно, дыхание у микроорганизмов является сложным процессом, представляющим собой цепь последовательных окислительно-восстановительных реакций с участием многих ферментов.

Определенное представление о характере процесса дыхания дает так называемый дыхательный коэффициент. Отношение объема выделившегося углекислого газа к объему кислорода, поглощен­ ного в процессе дыхания (СОгіОг), называется дыхательным коэффициентом.

В реакции окисления углеводов (СбНі206 + 6 0 2 = 6С02 + 6Н20) дыхательный коэффициент С 0 2 : 0 2 = 1 . Он будет меньше 1 тогда, когда в процессе дыхания окисляются вещества с относительно небольшим содержанием кислорода, например белки, угле­ водороды. Дыхательный коэффициент будет меньше 1 и в том случае, если наряду с аэробным дыханием протекают другие про­

высоким содержанием кислорода, чем в углеводах, например органические кислоты (винная, щавелевая) и их соли, то дыха­ тельный коэффициент будет значительно больше 1. Он будет больше 1 и при дыхании тех дрожжей, у которых одновременно с аэробным дыханием происходит спиртовое брожение. Таким образом, зная значение дыхательного коэффициента, можно опре­ делить, какие вещества окисляются в процессе дыхания.

Итак, жизненно необходимую энергию микроорганизмы полу­ чают или в результате дыхания, заключающегося в использова­ нии кислорода и в полном превращении органических соединений в углекислоту и воду, или в процессе брожения, которое проис­ ходит без участия кислорода и заканчивается образованием продуктов неполного окисления.

Способность дрожжей к жизнедеятельности в аэробных и ана­ эробных условиях используется в производстве. Аэробное окисле­ ние, связанное с освобождением большого количества энергии, вызывает у дрожжевой клетки способность к активному почкова­ нию. Следовательно, при выращивании дрожжеподобных грибов для накопления биомассы дрожжей необходимо создавать усло­ вия для интенсивной аэрации питательной среды.

^Для получения больших количеств спирта процесс брожения следует вести в анаэробных условиях, без свободного кислорода, в этом случае размножение клеток прекращается и наступает усиление процесса брожения. Таким образом, в результате разных типов дыхания — аэробного и анаэробного — из сахара можно получить различные продукты.

Закон взаимосвязи между дыханием и брожением носит назва­ ние эффекта Пастера. Под ним подразумевают торможение или подавление брожения под влиянием кислорода или перемену типа дыхания с анаэробного на аэробный. Пользуясь эффектом

196

Пастера, можно регулировать спиртовое и дрожжевое производ­ ства.

Энергетический эффект различных типов дыхания. В результате аэробного дыхания происходит полное превращение окисляемых веществ в углекислоту и воду; при этом" вся связанная энергия освобождается. Так, при использовании дрожжами глюкозы одна ее грамм-молекула, т. е. 180 г, выделяет 686 ккал тепла. При анаэробном дыхании происходит неполное окисление органиче­ ских веществ и одна грамм-молекула глюкозы выделяет только 56 ккал тепла, так как этиловый спирт сохраняет значительную часть энергии в связанном виде и его можно использовать в каче­ стве энергетического материала для других микроорганизмов. Следовательно, процесс дыхания благоприятнее для снабжения клетки энергией, так как в этом случае молекула сахара расщепляется более глубоко. При анаэробном дыхании для полу­ чения определенного количества энергии расходуется значительно больше энергетического материала (например, углеводов). Следо­ вательно, с энергетической точки зрения процессы брожения являются менее экономными, чем процессы дыхания. Каким же образом микроорганизмы выработали такой энергетически не­ выгодный процесс? Почему им выгодно для получения энергии расходовать большое количество питательных веществ? Во-первых, потому, что процессы распада, идущие в отсутствии кислорода, эволюционно более древние, они появились еще тогда, когда в составе земной атмосферы не было кислорода. Во-вторых, кислород, необходимый для окисления органических веществ при аэробном дыхании, не так широко распространен в природе. Его нет на дне водоемов со стоячими водами, где имеется наиболь­ шее количество органических веществ. В таких условиях могут жить только анаэробные микроорганизмы, получающие необхо­ димую для их жизнедеятельности энергию в результате различ­ ных брожений. И, наконец, несмотря на то, что при брожении для получения энергии и расходуется большое количество питательных веществ, создаются условия, в которых не развиваются другие микробы, конкурирующие с микроорганизмами, вызывающими брожение. Так, продукт жизнедеятельности дрожжей этиловый спирт оказывает губительное действие на многие бактерии и плесени. Таким образом, анаэробное дыхание для многих микробов является целесообразным и оправданным жизненным процессом.

Микроорганизмы в процессе своей жизнедеятельности выделяют в окружающую среду тепловую или световую энергию. Тепла выделяется в результате неполного использования микроорга­ низмами энергии окисления органических веществ. Методом калориметрии установлено, что для своей жизнедеятельности микробы обычно используют 50—60% от общего количества выделяющейся при дыхании энергии, а многие не более 20—25%. В результате выделения микроорганизмами тепла в окружающую среду происходит саморазогревание некоторых органических

197

материалов — навоза, торфа. В этих условиях развиваются термо­ фильные микроорганизмы.

Некоторые микроорганизмы, принадлежащие к группе аэробных бактерий и грибов, выделяют часть энергии при окислительных процессах во внешнюю среду в виде света. Свечение микробов связано с наличием особых ферментов и свободного кислорода, который интенсивно окисляет фотогенные вещества, находящиеся в их теле.

Для жизнедеятельности светящихся микробов необходимы соли NaCl, KCl, поэтому они чаще встречаются в морской воде. Чем больше приток кислорода, тем интенсивнее и ярче свечение микро­ организмов.

Г л а в а IX ОСОБЕННОСТИ

РАЗВИТИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ В ГИДРОЛИЗНОМ И СУЛЬФИТНОМ СУСЛЕ

1. ХАРАКТЕРИСТИКА ГИДРОЛИЗАТОВ И СУЛЬФИТНЫХ ЩЕЛОКОВ

КАК ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ

Гидролизаты, получаемые в результате гидролиза древесных отходов и отходов от переработки сельскохозяйственного расти­ тельного сырья (сельскохозяйственных отходов), а также сульфит­ ные щелока — неблагоприятные и недостаточно полноценные среды для жизнедеятельности микроорганизмов. Эти среды пред­ ставляют полидисперсную многокомпонентную систему. Состав гидролизатов приведен на стр. 82. Гидролизаты и сульфитные щелока содержат моносахариды, состоящие из гексоз и пентоз. Сбраживаемыми на спирт сахарами являются гексозы, состоящие из глюкозы, маннозы, галактозы и небольшого количества фрук­ тозы. В состав несбраживаемых пентоз входят ксилоза и араби­ ноза. В гидролизатах содержатся также неинвертированные сахара (декстрины и олигосахариды), являющиеся продуктами неполного гидролиза полисахаридов.

В процессе гидролиза растительного сырья, кроме сахаров, образуются различные примеси. К ним относятся: летучие орга­ нические кислоты — муравьиная, уксусная, пропионовая; нелетучие органические кислоты — левулиновая, альдобиуроновые, щавеле­ вая, смоляные и высшие жирные кислоты; продукты разложения

198

и растворения части лигнина. Часть из них находится в раство­ ренном виде, а часть — в коллоидном состоянии.

Гидролизаты, полученные в результате гидролиза лиственной древесины и сельскохозяйственных отходов, содержат больше пентоз, фурфурола, альдобиуроновых кислот, меньше гексоз, и в них отсутствуют терпены. Гидролизаты сельскохозяйственных отходов содержат органические кислоты, минеральные и азоти­ стые вещества. Хлопковые гидролизаты содержат много органиче­ ского азота, 40—45% азота составляют белки и аминокислоты. Все эти вещества находятся в гидролизате как в растворенном, так и в коллоидном состоянии.

В состав гидролизатов входят также серная кислота (0,4—0,6%) или другая минеральная кислота, являющаяся катализатором при гидролизе, и продукты взаимодействия их с зольными элементами сырья. Благодаря наличию минеральных и органических кислот

содержится меньше, чем в гидролизате, моносахаридов (1,7—3,1% в зависимости от жесткости сульфитной варки). Из них гексозы составляют 1,1—2,2%, а пентозы 0,7— 1,2 %• В состав сульфитного щелока входят летучие и нелетучие вещества. К первым относятся: уксусная (0,2—0,4%), муравьиная (0,04—0,09%), свободная сернистая (0,06—0,10%) кислоты; метиловый спирт (0,03—0,06%), формальдегид (0,02—0,05%), фурфурол (0,02— 0,06%). Общее количество летучих веществ составляет 0,4—0,9%. К нелетучим веществам относятся: лигносульфоновые кислоты (3,5—7,0%), продукты окисления и разложения моносахаридов — глицериновый альдегид (0,01—0,02%)-, метилглиоксаль (0,04— 0,07%) и др.

При варке целлюлозы высокого выхода в щелоке содержатся олигосахариды. В сульфитном щелоке имеются также минераль­ ные соли сернистой, серной и других кислот: бисульфит кальция (0,03—0,8%), моносульфит (0,03—0,07%). Часть сахаров щелока связывается с бисульфитом или сернистой кислотой, образуя альдегидбисульфитные соединения (0,3—0,6%). Кислотность щелоков мягких и жестких варок различна: в первом случае pH равен 2,5—3,5, во втором 1,9—2,5. Температура щелока, отобран­ ного из котла, равна 80—95° С.

Многие из перечисленных веществ, входящих в состав гидро­ лизатов и сульфитного щелока, отрицательно влияют на жизне­ деятельность микроорганизмов, в частности дрожжей и дрожже­ подобных грибов, а следовательно, и на процессы спиртового брожения и выращивания кормовых дрожжей.

В гидролизных средах основным фактором, подавляющим обмен - веществ, рост и размножение дрожжей, является фурфурол. Тормозящее действие фурфурола на дыхание и накопление био­ массы дрожжей проявляется начиная с концентрации его в среде

199