книги из ГПНТБ / Технология гидролизных производств учебник

0,02%- При концентрации 0,05—0,06% резко снижается степень утилизации сахара и выход биомассы, а при 0,1% подавляется

относятся к действию фурфурола. Наиболее чувствительны к нему дрожжеподобные грибы вида Candida scottii расы Кр-9. В не­ благоприятных условиях они чувствительны к концентрации фур­ фурола 0,02%, а при адаптации могут переносить концентрации его в среде 0,08—0,1%. Кроме того, в условиях непрерывного процесса и обильного доступа воздуха дрожжи могут переносить более высокие концентрации фурфурола. Особенно отрицательно действует фурфурол в начальной фазе размножения дрожжей. И только после превращения фурфурола в фурфуриловый спирт начинается накопление биомассы дрожжей. На процесс образо­ вания спирта фурфурол влияет при содержании в среде более 0,05-0,1% .

Оксиметилфурфурол (ОМФ), как и фурфурол, является ингиби­ тором процесса выращивания кормовых дрожжей. ОМФ оказы­ вает токсическое действие и на спиртовые дрожжи. При концен­ трации ОМФ 0,4—0,5% наступает значительное торможение спиртообразования у заводских дрожжей и при 0,3% у неадап­ тированной культуры. Содержание в среде 0,1—0,2% ОМФ не отражается на выходе спирта, тогда как выход биомассы кормо­ вых дрожжей снижается на 10%. Под действием ОМФ происходит ослабление деятельности фермента каталазы, снижение интенсив­ ности дыхания дрожжей, а следовательно, и торможение про­ цесса выращивания, в результате чего снижается прирост биомассы. Так, при содержании ОМФ в среде 0,3% интенсивность дыхания дрожжей снижается на 23%, а при 0,5% наблюдается полное подавление их жизнедеятельности.

Формальдегид при концентрации 0,004% замедляет размноже­ ние дрожжей на 52%, а при концентрации 0,006% — на 86%. Было установлено также, что при концентрации формальдегида 0,09% нарушается нормальная жизнедеятельность дрожжей, а при кон­ центрации 0,1% приостанавливается рост дрожжевых клеток.

Соли тяжелых металлов даже при незначительных концентра­ циях (например, соли меди при 0,004%. серебро при 0,000001%; мышьяк при 0,0005%) тормозят брожение и задерживают размно­ жение дрожжей.

В питательной среде не должно содержаться лигногуминовых веществ. Находясь в гидролизатах в тонкодисперсном и коллоид­ ном состоянии, они могут адсорбироваться на поверхности дрожжевых клеток, уменьшая их активную поверхность и тормозя процессы обмена. Так, скорость поглощения кислорода дрожже­ подобными грибами и, следовательно, интенсивность дыхания уменьшаются при наличии в среде 0,1% лигногуминовых веществ.

200

ные вещества коагулируют, выпадают из субстрата и примешива­ ются к дрожжевой массе. Наружная оболочка клетки сорбирует эти вещества из среды, в результате чего дрожжи становятся горькими и темными. Выход биомассы дрожжей снижается на 60—72% при наличии в субстрате 0,15—0,2% смолистых веществ. Токсическое действие их проявляется в снижении интенсивности дыхания и ферментативной активности дрожжей.

Основным вредно действующим на дрожжи веществом сульфит­ ного щелока является сернистый ангидрид. Отрицательное дей­ ствие на брожение оказывает титруемый SÖ2 в количестве

Полностью прекращается рост дрожжей при концентрации 0,2% титруемого S 0 2 и 0,4% альдегидносвязанного S 0 2. Альдегидбисульфитные соединения не сбраживаются дрожжами. Тормозящее действие бисульфитных соединений на процесс брожения объяс­ няется тем, что уксусный альдегид, образующийся в процессе спиртового брожения как промежуточный продукт, не превраща­ ется в дальнейшем в этиловый спирт, а дает с бисульфитом стойкое соединение, которое дрожжи не могут сбродить. При кон­ центрации альдегидбисульфитных соединений в щелоке 0,8% брожение практически прекращается. Кроме того, бисульфит и сернистая кислота оказывают угнетающее действие на дрожжи, снижая их спиртообразующую способность. Так, при концентра­ ции свободного S 0 2 более 0,015% дрожжи полностью теряют способность сбраживать сахар. Отрицательное влияние бисуль­ фита на дрожжи проявляется в меньшей степени. Лишь при кон­ центрации его 0,1% Дрожжи перестают сбраживать сахар.

На основании сказанного можно сделать вывод, что гидроли­ заты и сульфитные щелока являются средами, недостаточно пригодными для жизнедеятельности микроорганизмов по следую­ щим причинам: 1) в этих средах отсутствуют легкоусваиваемые соединения азота и недостаточно фосфорных соединений; 2) отсут­ ствуют биостимуляторы роста и витамины; 3) в гидролизатах и щелоках в значительном количестве содержатся различные вред­ ные примеси, снижающие биологическую доброкачественность сред, нарушающие нормальные физиологические функции дрож­ жей и дрожжеподобных грибов и тормозящие их развитие. К таким примесям относятся: фурфурол, оксиметилфурфурол, сернистый ангидрид, формальдегид, лигногуминовые вещества. Снижают биологическую доброкачественность также декстрины и растворимые полисахариды, содержащиеся в гидролизатах и щелоках.

Под биологической доброкачественностью гидролизатов и щелоков следует понимать показатель, отражающий степень влияния вредных примесей среды на процесс выращивания дрожжей или выход полезных продуктов их жизнедеятельности.

Таким образом, биологическая доброкачественность сред за­ висит от содержания в них примесей, мешающих развитию

201

микроорганизмов, отрицательно действующих на их жизнедеятель­ ность, тормозящих процессы спиртового брожения и выращивания дрожжей. Доброкачественность сред определяют биологическим методом, например по выходу биомассы дрожжей или по количе­ ству углекислоты, выделившейся при спиртовом брожении в единицу времени. Чем меньше выход, тем ниже биологическая доброкачественность среды. О доброкачественности среды можно судить и по физиологической активности дрожжей. Доброкаче­ ственной средой следует считать такой субстрат, где функция размножения дрожжевых клеток не подавляется и не замедля­ ется, и клетки синхронизированно (одновременно) и в короткий срок удваивают свою численность и массу, и это удвоение проте­ кает с экономной тратой сахара.

Для получения биологически доброкачественных гидролизатов и сульфитных щелоков и создания оптимальных условий для эф­ фективной жизнедеятельности дрожжей необходимо эти среды соответствующим образом подготовить.

1. Питательная среда должна быть слабокислой. Активная кислотность ее в значительной степени влияет на деятельность ферментов дрожжей и на состояние их клеток, состоящих в основ­ ном из коллоидных веществ. Поэтому минеральные кислоты и большую часть органических нейтрализуют и этим уничтожают их токсическое действие на микроорганизмы. Для того чтобы дрожжи наиболее эффективно сбраживали древесный сахар на спирт, pH среды должен быть оптимальным и равным для древес­ ных гидролизатов 4,2—4,5; для гидролизатов, полученных из сельскохозяйственных отходов, pH сусла должен быть более низким, 3,8—4,0, так как оно легко заражается посторонними микроорганизмами; для сульфитных щелоков от варок в жестких условиях — 5,0—5,8, от варок в мягких условиях — 4,5—5,2. Для выращивания кормовых дрожжей необходимо нейтрализовать избыточную кислотность до pH 4,8—5,3. Процесс непрерывного выращивания можно вести при pH 3,8—4,0, если нет прямого воздействия минеральных кислот на дрожжеподобные грибы

ив среде содержатся в основном органические кислоты.

2.Питательная среда не должна содержать вредные примеси.

Летучие ядовитые вещества (фурфурол, метанол, формальдегид, терпены и др.) в основном удаляются со сдувочными парами или с парами самоиспарения гидролизата при продувке его паром и вакуум-охлаждении. Так, в результате вакуум-охлаждения содер­ жание фурфурола снижается в среднем на 28%, ОМФ — на 27%. Выход дрожжей повышается на 10%• Часть фурфурола восста­ навливается дрожжами в фурфуриловый спирт. Сернистый ангидрид, метиловый спирт и другие летучие примеси удаляются из щелока при продувке его паром или воздухом при температуре 70—80° С. Альдегидбисульфитные соединения разрушаются при удалении сернистой кислоты нейтрализацией или продувкой щелока воздухом.

2 0 2

Для освобождения от оксиметилфурфурола горячие гидролизаты продувают воздухом. В процессе жизнедеятельности дрожжей, особенно дрожжеподобных грибов, происходит также восстанов­ ление ОМФ до соответствующего спирта и, следовательно, снижение содержания его в" субстрате. Образующийся спирт утилизируется дрожжами. Часть коллоиднорастворенных веществ гидролизатов коагулирует при нейтрализации и во время охлаж­ дения нейтрализата; часть их адсорбируется активированным углем или коагулирует при действии различных химических реагентов и вместе с загрязнениями, взвешенными частицами отделяется при отстое и фильтрации. Аэрация сусла также облагораживает его и повышает биологическую доброкачествен­ ность в результате окисления и коагуляции лигногуминовых и дру­ гих веществ.

Полного удаления вредных примесей из гидролизатов и суль­ фитных щелоков не удается достичь. Некоторое количество их остается в сусле, однако они практически не влияют на выращи­ вание дрожжей и спиртообразование. Дрожжи постепенно к ним привыкают, акклиматизируются, вырабатывают новые ферменты, изменяют свои свойства. Установлены предельно допустимые кон­ центрации некоторых из вредных примесей. Так, содержание фурфурола в питательной среде не должно превышать 0,03—0,04%, оксиметилфурфурола 0,05—0,10% для дрожжеподоб­ ных грибов и 0,3% для спиртообразующих дрожжей, свободного S 0 2 0,005%, непосредственно титруемого S 0 2 0,03—0,06%, бисуль­ фита 0,03%, альдегидносвязанного S 0 2 0,2—0,3%. При непрерыв­ ном способе выращивания дрожжей величина допустимых дозировок токсических веществ возрастает. Например, допустимая концентрация ОМФ при выращивании дрожжей на гидролизате составляет 0,2%.

3. Неинвертированные сахара — декстрины и олигосахариды — не утилизируются дрожжами и снижают биологическую доброка­ чественность гидролизных сред. Кроме того, декстрины плохо ис­ пользуются микроорганизмами-минерализаторами при очистке сточных вод и увеличивают их ВПК. Для повышения биологиче­ ской доброкачественности необходимо производить инверсию гидролизатов и щелоков. Приватом происходит не только гидролиз растворимых полисахаридов до моносахаридов, но и ряд реакций,

врезультате которых снижается содержание оксиметилфурфурола

иколлоидных веществ; последние при этом частично коагулируют

ивместе со смолистыми веществами выпадают в осадок. Количе­ ство вредных веществ уменьшается за счет поликонденсации

фурфурола и ОМФ.

4. В гидролизном и сульфитном сусле содержится недостаточ­ ное количество соединений азота, фосфора и калия, поэтому его обогащают питательными солями-— сульфатом аммония, супер­ фосфатом, хлористым калием или добавляют водный раствор ам­ миака. В этом случае скорость сбраживания сахара и накопление

203

щий ферменты и способный сбраживать сахар на спирт и угле­ кислоту, долгое время не удавалось.

В 1871 г. М. М. Манассеина впервые установила, что спиртовое брожение может происходить под действием клеточного сока без участия живых дрожжей. Бесклеточный дрожжевой сок она полу­ чила путем растирания дрожжей с измельченным горным хрусталем. Немецкий ученый Э. Бухнер в 1897 г. получил клеточ­ ный сок из растертых дрожжей путем прессования под большим давлением, равным 500 кгс/см2, и с ним проводил спиртовое бро­ жение. Таким образом было доказано, что процесс брожения вызывается не собственно дрожжевыми клетками, а ферментами или энзимами, содержащимися в них (по-гречески «эн зюме» обозначает «в дрожжах»), В 1911 г. русский ученый А. Н. Лебедев (1881— 1938) предложил наиболее совершенный метод получения ферментного сока из дрожжей. Подсушенные в термостате при 25—30° С дрожжи обрабатываются водой в течение 2 ч при темпе­ ратуре 35° С и затем отфильтровываются. Этот дрожжевой сок получил название мацерационного сока Лебедева (мацерация обозначает выщелачивание, размачивание). Исследователи раз­ ных стран применяют этот сок для изучения химизма спиртового брожения.

В дрожжевом соке были найдены различные ферменты, в част­ ности комплекс ферментов, участвующих в спиртовом брожении (до расшифровки его называли зимаза). Дальнейшие исследова­ ния показали, что некоторые ферменты после диализа инактивиру­ ются вследствие удаления коферментов, причем активность ферментов может быть восстановлена добавлением диализата, т. е. веществ, удаляемых при диализе. Эти вещества, в отсутствии которых спиртовое брожение прекращается, были названы коферментами. Следовательно, для брожения необходимы как ферменты, так и коферменты. Процесс брожения, вызываемый клеточным ферментным соком, оказался аналогичен брожению живыми дрожжевыми клетками.

Многие исследователи изучали вопросы спиртового брожения. В 1903 г. Л. А. Иванов впервые установил значение фосфорной кислоты и ее соединений для процессов брожения. Он показал, что в присутствии неорганических соединений фосфора скорость брожения быстро возрастает; стимулирующее действие фосфата сводится к образованию промежуточных соединений фосфорной кислоты (фосфорных эфиров), способных к дальнейшим превра­

пользуя ферментный сок, полученный по его методу. Английские ученые А. Гарден и Т. Юнг в 1907 г. разработали схему спирто­

промежуточный продукт спиртового брожения, восстанавливаю­ щийся в этиловый спирт, и установил общие черты в спиртовом,

205

маслянокислом и молочнокислом брожении. В 1933 г. была предложена схема спиртового брожения, которая получила назва­ ние схемы Эмбдена — Мейергофа. Сложные превращения сахара, происходящие при спиртовом брожении, промежуточные продукты и ферменты, участвующие в этом процессе, изучались многими исследователями. Для выделения и изучения промежуточных продуктов и ферментов осуществляли бесклеточное брожение при помощи ферментного сока и, применяя ингибиторы и специфиче­ ские яды, останавливали этот процесс на определенных стадиях. Ингибиторы угнетали какие-нибудь отдельные звенья сложного процесса брожения, яды парализовали действие отдельных фер­ ментов, оставляя нетронутыми другие. Добавление ядов привело к накоплению продуктов промежуточного обмена, которые были изолированы и идентифицированы. Был применен также принцип улавливания, т. е. химическое связывание промежуточных продук­ тов брожения. Особенно хорошие результаты в изучении химизма брожения были получены при использовании веществ с мечеными атомами. Чаще всего использовали радиоактивный углерод С14 и фосфор Р32, позволяющие распознавать их в составе новообра­ зующихся соединений. На основании полученных данных делали выводы о механизме превращения исходного субстрата в конеч­ ные продукты.

Большую роль в изучении действия ферментов и их природы

с выделением определенного количества энергии. Спиртовое бро­ жение производят дрожжи, мукоровые грибы и бактерии. Мукоровые грибы применяются в Азии для получения слабоалкогольных напитков. К ним относятся крахмальные (Amylomycetes) и мукоровые грибки. Крахмальные грибки образуют фермент амилазу, которая превращает крахмал, например, кукурузы в декстрины и мальтозу, а фермент мальтаза расщепляет их до глюкозы. Последняя сбраживается мукоровым грибком с образо­ ванием 5—6% этилового спирта и углекислоты. Эти процессы происходят в присутствии небольшого количества кислорода. Мукоровые грибки относятся к роду ризопов, например Rhizopus japonicus, содержат различные ферменты (сахаразу, инулазу, амилазу, спиртообразующие ферменты) и поэтому расщепляют сахарозу, инулин, крахмал и вызывают спиртовое брожение. Не­ достатком брожений, вызываемых мукоровыми грибками, является то, что они для своей жизнедеятельности используют большое количество углеводов и на поверхности бродящей жидкости обра­ зуют воздушный мицелий. В Южной Америке для сбраживания углеводов применяются бактерии Ps. lindneri, образующие спирт и углекислоту.

206

Основными микроорганизмами, вызывающими спиртовое бро­ жение, являются дрожжи. Они наиболее широко применяются

в нашем народном хозяйстве.

Химизм спиртового брожения. В результате спиртового броже­

ния молекула гексозы распадается на две молекулы этилового спирта и две молекулы углекислоты по уравнению Ж. ГейЛюссака. При этом выделяется определенное количество энергии, необходимой для жизнедеятельности дрожжей. Энергия, образую­ щаяся в результате окислительно-восстановительных реакций, ак­

кумулируется в форме макроэргических фосфатных связей ( ~ Р ) аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ). За счет непрерывно регенерирующейся в клетках АТФ энергия по мере надобности используется для жизнедеятельности микроорганизма.

С6Н120 6= 2 С 2Н50 Н + 2 С 0 2+ 5 6 ккал.

Это уравнение показывает только конечный результат.

Процесс превращения сахара в спирт является сложным био­ химическим процессом, протекающим в несколько ступеней, не­ прерывно следующих друг за другом. Установить химизм спирто­ вого брожения стало возможным только после открытия бесклеточного брожения, так как в этом случае процессы спирто­ вого брожения можно изучать независимо от всех других жизнен­ ных процессов— роста, размножения и разных химических превращений, сопровождающих брожение живых дрожжей.

Исследование процессов брожения ферментного дрожжевого сока показало, что эти процессы катализируются группой по­ следовательно действующих ферментов, в ходе брожения образу­ ются различные промежуточные и побочные продукты. Как отмечалось ранее, большую роль в брожении играют соединения фосфорной кислоты. По принятой в настоящее время схеме химизма спиртового брожения этот процесс распадается на не­ сколько ступеней.

и гексозы (реакция фосфорилирования). Источником фосфорной кислоты является АТФ. Молекула АТФ состоит из пуринового основания аденина, рибозы и трех молекул фосфорной кислоты.

он он

207

В результате присоединения к глюкозе остатка фосфорной кислоты образуется эфир 6-глюкозомонофосфат и аденозиндифосфорная кислота (АДФ):

Этот процесс катализируется ферментом гексокиназой (глюко­ киназой). Затем под влиянием фермента глюкозофосфатизомеразы происходит внутримолекулярная изомеризация, в резуль­ тате чего 6-глюкозомонофосфат превращается в 6-фруктозомоно- фосфат:

Затем еще один остаток фосфорной кислоты отщепляется от второй молекулы АТФ и присоединяется к 6-фруктозомоно­ фосфату, вследствие чего образуется новый эфир 1,6-фруктозоди- фосфат и АДФ. Эта реакция катализируется ферментом фосфо-

208

II ступень. В результате присоединения двух остатков фосфор­ ной кислоты углеродная цепь 1,6-фруктозодифосфата становится неустойчивой и под влиянием фермента альдолазы происходит разрыв ее как раз в середине, т. е. между третьим и четвертым атомами углерода. Разрыв в этом месте облегчается тем, что остатки фосфорной кислоты симметрично расположены по концам молекулы фруктозы. При этом фруктозодифосфат распадается на две фосфорилированные триозы: фосфодиоксиацетон и 3-фосфо- глицериновый альдегид. Этот процесс обратим.

1, 6-фруктозодифосфат фосфодиоксиацетон 3-фосфоглицериновый альдегид

В дальнейшем 3-фосфоглицериновый альдегид превращается в фосфоглицериновую кислоту. Но и фосфодиоксиацетон не теряет' значения для брожения. В дрожжевом соке был найден фермент

Таким образом, по мере использования 3-фосфоглицеринового альдегида для дальнейших превращений он образуется вновь.

III ступень. Заключается в окислении 3-фосфоглицеринового альдегида в 1,3-дифосфоглицериновую кислоту. Фермент, катали­ зирующий эту реакцию, называется дегидрогеназой фосфоглицеринового альдегида (фосфоглицеринальдегиддегидрогеназой), коферментом которого у дрожжей является никотинамидадениндинуклеотид (НАД). Действие фермента состоит из нескольких последовательно идущих реакций. Вначале 3-фосфоглицериновый альдегид связывается с дегидрогеназой через S — Н-группы