Лабораторне заняття № 18-19 тема: Ветеринарно-санітана експертиза риби.

Мета роботи: засвоїти методи оцінки якості риби.

Завдання: провести ветеринарно-санітарне дослідження оселедця та річкової риби.

Місце проведення лабораторних занять.Лабораторія №60 кафедри паразитології та ветеринарно-санітарної експертизи.

Спеціальне обладнання та устаткування: Предметні скельця, спиртівки, пінцети, ножиці, колби на 100, 250 см³, піпетки на 1, 5, 20см3 пробірки, рН-метр, смужки фільтрувального паперу, просочені розчином оцтового свинцю; паперові фільтри, мікроскоп. Розчин генціанвіолету, розчин фуксину, розчин Люголя, 96⁰ етиловий спирт, розчин Неслера; 10 % розчин K₂Cr₂O₇, 0,1Н розчин азотнокислого срібла.

Методика проведення занять.

Методи дослідження на дифілоботріоз. Розтинають черевну порожнину риби, дивляться на поверхню кишечника, шлунка, печінки та ікри на наявність фібринозних капсул. Личинки можуть бути без капсул, довжиною 1-2 см, шириною 1-2 мм. Із м’язів вирізають 3-4 поперечних шматочка товщиною 0,5 см, які досліджують неозброєним оком на плероцеркоїди. При виявленні їх досліджують під мікроскопом. Плероцеркоїди стьожка широкого не мають на голові гачків.

Метод дослідження на метагонімоз:з внутрішньої поверхні луски знімають плівку. Крупну луску просвітляють гліцерином, поміщають в краплю води і мікроскопують. Так само досліджують плавники, зябра. Метацеркарії кулеподібної чи овальної форми діаметром 0,18-0,21 мм. В середині цисти помітна личинка підковоподібної форми.

Метод дослідження на опісорхоз: для дослідження із різних ділянок спинних м’язів вирізають 5-8 шматків товщиною 2-3мм, здавлюють між предметними скельцями або пластинками компресоріума і продивляються під малим збільшенням мікроскопу або під трихінелоскопом.

Характерна особливість личинок опісторхісів є наявність в середині цисти метацеркаріїв з двома присосками і великою чорною зернистою плямою (пігментований сечовий міхур).

Анізакідоз. Вражаються лише морська та океанічна риба. Методи дослідження: для дослідження риби на зараження її гельмінтами і личинками анізакід відбирається 5-6 кг риби, рибопродуктів з кожної партії. Якщо риба великих розмірів, то відбирається не менше 3 екземплярів.

Рибу досліджують як свіжовиловлену, дефростовану, так і солону, копчену, в’ялену.

Розтин риби можна проводити у великій емальованій кюветі, але краще робити на широкій дерев’яній чи пластиковій дошці. Під час розтину риби рекомендується дотримуватися відповідної послідовності. Спочатку роблять короткий надріз вперед від анального отвору, у надріз вводять тупий кінець ножиць і розрізають рибу впродовж по середній лінії черевця. Розріз продовжують до кута нижньої щелепи на обидва боки. Після цього ретельно проглядають порожнину тіла і внутрішні органи, порожнину тіла протирають марлевою серветкою, одночасно зскрібаючи парентеральну очеревину.

Далі досліджують м’язову тканину. З цією метою знімають з тушки луску, тушку повністю розрізають на шматочки (пластинки товщиною не більше 3-5 мм і проглядають кожен шматочок під сонячним світлом чи штучному.

При масових дослідженнях на виявлення анізакісів у м’ясі риб його подрібнюють за допомогою будь-якого механічного дезінтегратора, а потім порції фаршу по 0,5 кг розкладають на спеціальний столик із скляною кришкою, фарш рівномірно розподіляють по склу шаром не товще 3-5 мм і проглядають у ультрафіолетову світлі з підсвічуванням знизу. Анізокіси в ультрафіолетовому світлі яскраво світяться і легко виявляються, особливо при дослідженні замороженої дефростованої риби.

Визначення життєздатності анізакісів.

Визначення життєздатності анізакід проводять при оцінці ефективності знезараження риби. Вилучення із черевної порожнини і м’язів анізакіди можуть бути нерухомі. Навіть слабкі рухи свідчать про їх життєздатність. Зміна кольору, відставання кутикули, деструктивні зміни тіла вказують на нежиттєздатність паразитів.

Найпоширенішим і надійнішим є ферментативний метод визначення життєздатності анізакід, вилучених із риби або рибопродуктів. Для цього паразитів кладуть у теплий (+35+40⁰С ) 0,5% розчин трипсину (стандартний розчин трипсину і розбавляють дистильованою водою або краще фізіологічним розчином). У тих випадках, коли анізакіди живі, вони проявляють ознаки рухливості.

Дотик до паразитів препарувальною голкою або подразнення електрострумом (0,5-1,5 В) стимулює їх активність, викликає скорочення тіла.

Для виявлення живих анізакід використовують барвники: малахітовий зелений; фуксин, феноловий червоний, сафранін, метиленовий синій, еозин.

Для фарбування використовують водний розчин одного із барвників у розведенні 1:1000 протягом 3-40 хвилин. Усі вони забарвлюють у відповідний колір тільки мертвих паразитів.

Бактеріоскопія.

На предметних скельцях роблять два мазки-відбитки: перший — з поверхневих шарів м'язів, другий — із м'язової тканини глибоких шарів, розміщених біля хребта. Виготовлені препарати фарбують за Грамом. Під мікроскопом підраховують середню кількість мікроорганізмів в одному полі зору.

У мазках з поверхневих шарів м'язів свіжої риби мікробів немає або виявляють поодинокі коки і палички в декількох полях зору. Препарат погано фарбується, на склі не помітні залишки розкладеної тканини.

У мазках з глибоких шарів м'язів риби сумнівної свіжості виявляють 10—20, а з поверхневих — 30—50 мікробних тіл в одному полі зору (диплококи, диплобактерії). Препарат фарбується задовільно, на склі добре помітні волокна м'язової тканини, що розклалась.

У мазках з глибоких шарів м'язів несвіжої риби виявляють 30—40, а з поверхневих — 80—100 і більше мікробів в одному полі зору (переважно паличковидних). Препарат добре фарбується, на склі багато м'язової тканини, що розклалась.

Визначення кухонної солі

10% водяний розчин хромовокислого калію з флакона відважують 10 г хромовокислого калію, кількісно переносять в мірну колбу на 100 мл, розчиняють в невеликій кількості дистильованої води, потім доводять дистильованою водою до позначки.

До 3 г ретельно подробленої м’язової тканини солоної риби додають 100 мл дистильованої води і екстрагують 30 хв при періодичному збовтуванні. До 20 мл екстракту додають індикатор 3-5 крапель 10% розчину хромовокислого калію й титрують розчином для визначення вмісту кухонної солі до прояви оранжево-червоного кольору, незникаючого після збовтування. Вміст кухонної солі в процентах визначають за формулою:

0.585*V*100

X= ^{_______________}

C*V₁

Де: X – вміст кухонної солі, %;

V – кількість розчину для визначення вмісту солі, мл;

V₁ – наваж кариби, г.

С – кількістб екстракту, взятого для екстрагування;

100 – кількість дистильованої води води, взятої для екстрагування, мл;

0,585 – коефіцієнт перерахування;

За вмістом кухонної солі рибу поділяють на слабо солону – 6-10%, середньо-солону – 10-14%, міцно-солону – більше 14%.

Визначення сірководню (з підігрівання проби) ГОСТ 7636-85

Метод заснований на взаємодії сірководню, який утворюється при псуванні риби, з свинцевою сіллю та появі на фільтрувальному папері від бурого до темно-коричневого кольору внаслідок утворення сірчистого свинцюю.

При дослідженні не патраної риби визначення сірководню може з’явитися одним із об’єктивних методів розпізнання її санітарної якості, так як накопичення сірководню частіше відбувається при розпаді білків в анаеробних умовах.

У широку пробірку вміщують пухким шаром шматки м’яса риби (5-7 г). Над пробою горизонтально підвішують смужку з щільного фільтрувального паперу, на нижню частину якого наносять 2-3 краплини діаметром не більш 3-4 мм лужного розчину оцтовокислого свинцю. Пробірку з пробою підігрівають на водяній бані при 48-52 С протягом 15 хвилин, після цього негайно оцінюють реакцію.

Санітарна оцінка.

Риба свіжа. Реакція відсутня.

Риба сумнівної свіжості. На папері зявляється слаба бура пляма (сліди сірководню).

Риба несвіжа. Колір від бурого до темно-коричневого,

Експресна редуктазна проба риби метиленовим блакитним (ГОСТ 9225-84)

Робочий розчин метиленового блакитного – до 1 мл насиченого спиртового розчину метиленового блакитного додають 39 мл дистильованої води. Термін зберігання 7 днів.

Метод полягає у здатності ферменту редуктази, який виділяють мікроорганізми, знебарвлювати органічні барвники метиленовим блакитним.

В пробірці вміщують 5 г рибного фаршу і заливають дистильованою водою. Вміст струшують і залишають на 30 хв. Потім підливають 1 мл 0,1% водного розчину метиленового блакитного, пробірку струшують, щоб фарш був рівномірно забарвлений, екстракт заливають шаром вазелінового масла висотою 1 см. Пробірку ставлять у термостат або на водяну баню при температурі 37 С, періодично спостерігають за знебарвленням. Для контролю ставлять таку ж пробірку з 5 г фарша без метиленового блакитного.

Санітарна оцінка.

Час знебарвлення метиленового блакитного, год	Орієнтована кількість бактерій у 1 г м’язової тканини риби	Санітарна оцінка риби
До 40 хв	Від 600 тис. і більше	Недоброякісна
40-2,5 год	Від 500 тис .до 600 тис.	Сумнівна свіжість
2,5 год та більше	Від 300 тис. до 500 тис.	Свіжа

Знебарвлення синього кільця під шаром вазелінового масла в розрахунок не приймається

Реакція на пероксидазу (ГОСТ 23392-78).

Бензидин солянокислий 0,2 розчин – вміст флакону (0,2 г) розчиняють в 100 мл 96 % етилового спирту. Термін зберігання – 7 діб.

Пероекис водню 1% розчин – відібрати з флакону 1 мл 33% перекису водню і розчинити у 33 мл дистильованої води. Термін зберігання – 1 доба.

Суть методу полягає у визначенні ферменту пероксидази, який утворюється в м’язовій тканині здорової риби та здатний відщеплювати кисень від перекису водню. У присутності ферменту пероксидази перекис водню окисляє бензидин, у результаті цього утворюється пара-хінондіамід, що з недоокисленим бензидином утворює сполуку забарвлену в блакитнувато-зелений колір, яке переходить у бурий.

У витяжках з м’яса здорової риби реакція на пероксидазу позитивна не пізніше 2 хвилин після додавання бензидину й перекису водню з’являється синьовате забарвлення, яке переходить у буре.В витяжках з мяса хворої риби в більшості випадків реакція на пероксидазу негативна протягом 2 хвилин після додавання бензидину й перекису водню колір витяжки не змінюється .

У пробірку наливають 2 мл фільтрату витяжки з м’яса, виготовленого в співвідношенні1:10 (екстрагувати 15 хв) із зяберної тканини, додають п'ять крапель 0,2 %-го спиртового розчину бензидину, струшують, додаютьі дві краплі 1 %-го розчину перекису водню. Суміш збовтують і спостерігають за зміною забарвлення.

Оцінка реакції.

Риба доброякісне	Синього забарвлення фільтрат набуває через 1-2 хв. Реакція доброякісна. Найбільша активність пероксидази за рНмяса до 6,9.
Риба сумнівної свіжості	Фільтрат фарбується в менш інтенсивний синій колір, поступово через 3-4 хв. переходить у коричневий колір. Менш активна реакція на пероксидази при рН межах 7,0-7,2.
Риба зіпсоване	Витяжка відразу стає коричневого кольру. Реакція негативна. Активність на пероксидази втрачається за рНмяса 7,3 і вище.

Реакція з сірчанокислою міддю ГОСТ 23392-78. У конічну колбу на 200 мл поміщають 20 г фаршу з спини мязів риби, наливають 60 мл дистильованої води і ретельно перемішують. Колбу накривають годинниковим склом і нагрівають 10хв на водяній бані., потім бульйон фільтрують через паперовий фільтр в пробірку, вміщену в посуд з холодною водою. Якщо в фільтраті залишаються пластівці, то його знов фільтрують. Після цього 2 мл бульйону наливають в пробірку, додають 3 краплі 5 % розчину сульфату міді, струшують 2-3 рази, витримують 5 хвилин і оціюють реакцію. Контролем служить бульйон без додавання сульфату міді.

Оцінка реакції.

Доброякісна риба - бульйон прозорий чи має легке помутніння

Риба сумнівної свіжості – бульйон помутнілий, утворюються пластівці.

Риба зіпсована – вміст пробірки набуває желеподібного стану.

Визначення вмісту аміно-аміачного азоту.

В колбу місткістю 100см³ поміщають 10см³ профільтрованої черезфільтрувальний папір водної витяжки з м'яса. Потім додають 40см³ дистильованої води і 3 краплі 10%-ного спиртового розчину фенолфталеїну. Вміст колби нейтралізують децинормальним розчином їдкого натру до слабо-рожевого забарвлення. Потім у колбу додають 10см³ формаліну, нейтралізованого за фенолфталеїном до слабо-рожевого забарвлення. В результаті звільнення карбоксильних груп суміш стає кислою і рожеве забарвлення зникає. Після цього вміст колби знову титрують децинормальним розчином їдкого натру до слабо-рожевого забарвлення. Оскільки 1см³децинормального розчину їдкого натру еквівалентний 1,4 мг азоту, кількість мілілітрів децинормального розчину натрію гідроксиду, витраченого на друге титрування, множать на 1,4 і отримують кількість азоту аміно-аміачного (мг) у 10см³ фільтрату витяжки.

Прісноводна свіжа риба містить у м'ясі до 0,69 мг аміно-аміачного азоту, риба сумнівної свіжості — 0,7—0,8, а несвіжа — понад 0,81 мг.

Вимоги щодо оформлення та порядку подання звіту лабораторної роботи. Студенти проводять дослідження, надають висновок про якість риби за результатами досліджень, законспектувати результати.

Описати стан:

Слизу________________________________________________________________________Очей_________________________________________________________________________Луски________________________________________________________________________ Зябер________________________________________________________________________Шкіри______________________________________________________________________

Плавців______________________________________________________________________

Черевця______________________________________________________________________Тугора_______________________________________________________________________Внутрішніх органів____________________________________________________________

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Наявність паразитарних захворювань_____________________________________________

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Висновок про якість досліджуваної риби:_________________________________________

Рекомендована література:

1. Ветеринарно-санітарна експертиза з основами технології стандартизації продуктів тваринництва / [О.М. Якубчак, В.І. Хоменко, С.Д. Мельничук та ін.]. – Київ: ТОВ «Біопром», 2005. – 800 с.

2. Практикум з ветеринарно-санітарної експертиза з основами технології і стандартизації м'яса і м’ясних продуктів / [О.М.Якубчак, М.В. Козак, В.В. Власенко та ін.] – Київ: «Компанія «Біопром», 2012. – 256 с.

3. Ковбасенко В.М. Ветеринарно-санітарна експертиза з основами технології і стандартизації продуктів тваринництва: навчальний посібник: в двох томах. – Київ: «ІНКОС», 2006. Т.1. – 416 с., Т.2 – 536 с.

4. Хоменко В.І. Ветеринарно-санітарна експертиза з основами технології і стандартизації продуктів тваринництва / В. І. Хоменко, В. М. Ковбасенко, М.К. Оксамитний. – Київ: Сільгоспосвіта, 1995. – 712 с.

Лабораторне заняття № 20-21