Фармакогностическое изучение растений рода тимьян (Thymus L.) как перспективного источника получения фитопрепаратов

идентифицировано 20 жирных кислот. Установлено, что среди насыщенных кислот преобладают пальмитиновая и бегеновая кислоты; ненасыщенные кислоты представлены преимущественно линолевой, линоленовой,

арахидоновой и олеиновой кислотами.

Проведено сравнительное исследование тритерпеновых соединений методом тонкослойной хроматографии. Сравнением с достоверными образцами в исследуемых видах сырья идентифицированы урсоловая и олеаноловая кислоты. Урсоловая кислота найдена в 6 видах: тимьяне меловом, тимьяне ползучем, тимьяне блошином, тимьяне Маршалла, тимьяне двуликом, тимьяне Черняева, а олеаноловая кислота в 5 видах: тимьяне Палласа, тимьяне меловом, тимьяне ползучем, тимьяне Маршалла и тимьяне Черняева. Тритерпеновые сапонины определенны количественно, их содержание колебалось от 0,40% до 4,60%. Проведено выделение и установление структуры урсоловой и олеаноловой кислот. В большинстве

видов исследуемых тимьянов тритерпеновые соединения изучены впервые.

С использованием различных методов хроматографии (тонкослойной,

бумажной, ВЭЖХ, газожидкостной хромато-масс-спектрометрии)

идентифицировано 27 фенольных соединений, из них 7 фенолокислот и

5 оксикоричных ксилот, 3 кумарина, 12 флавоноидных соединений.

Большинство фенольных соединений в исследуемых растениях идентифицировано впервые. Проведены выделение в индивидуальном состоянии и идентификация 20 веществ фенольной природы. Среди выделенных фенольных соединений идентифицированы фенолокислоты:

ванилиновая, n-оксибензойная, галловая; оксикоричные кислоты: кофейная,

феруловая, n-кумаровая, розмариновая. Флавоноидные соединения представлены флавонами, их агликонами и монозидами. Выделенные

агликоны разделились на два ряда: В-незамещенные: байкалеин

(5,6,7-триоксифлавон) и В-замещенные. В-замещенные флавоны по

(5,7,4'-триоксифлавон или апигенин) до 3', 4'-замещенных (5,7,3',4'

тетраоксифлавон или лютеолин). При дополнительных замещениях в этих соединениях окси- и метоксигруппами образуются ряды производных апигенина: скутеллареина (6-оксиапигенина), изоскутеллареина

(8-оксиапигенина), акацетина (5,7-диокси, 4'-метоксифлавона) и

производных лютеолина: норнепетина (6-оксилютеолина), гиполеатина

(8-оксилютеолина), хризоэриола (5,7,4'-триокси, 3'-метоксифлавона),

диосметина (5,7,3'-триокси, 4'-метоксифлавона). Флавоновые гликозиды представлены 7-О-моногликозидами: цинарозидом, космоссиином,

скутелларином.

Установлено, что хемотоксономическими маркерами растений рода тимьян среди оксикоричных кислот является розмариновая кислота, среди флавонов – цинарозид (лютеолин-7-О-глюкозид), что можно использовать для целей стандартизации.

Впервые изучены углеводные комплексы, в составе которых обнаружены как свободные, так и связанные сахара. Проведено выделение водорастворимых полисахаридных комплексов и пектиновых веществ.

Изучен их качественный и количественный состав. Впервые исследован состав аминокислот и органических кислот растений рода тимьян. В

исследуемых растениях установлено наличие 19 минеральных элементов.

Впервые проведено сравнительное морфолого-анатомическое исследование 7 видов тимьянов, выявлены морфологически и микродиагностические признаки, позволяющие проводить диагностику сырья морфологически близких видов.

Впервые проведен фармакологический скрининг 6 видов тимьянов в сравнении с тимьяном ползучим. Впервые установлено наличие отхаркивающей, противовоспалительной, ангиопротекторной активностей.

Изучена антибактериальная активность настоев и эфирного масла,

полученных из исследуемых растений. Экспериментально установлена

12

антиоксидантная активность водно-спиртовых извлечений. Наиболее выраженная антиоксидантная активность проявляется у извлечений,

полученных с помощью спирта этилового 70% и 50%.

Результаты изучения химического состава явились основанием для разработки унифицированной методики качественного и количественного определения флавоноидов в сырье тимьяна ползучего и других видах, а

также в жидком экстракте в перерасчете на доминирующий флавоноид -

цинарозид. Впервые предложена спектрофотометрическая методика определения гидроксикоричных кислот в перерасчете на розмариновую кислоту для растений рода тимьян.

Усовершенствована технология получения жидкого экстракта тимьяна ползучего с использованием вакуум-фильтрационного способа экстрагирования.

Научная новизна исследований защищена патентом: «Способ получения олеаноловой кислоты» (№ 2538213).

Таким образом, теоретически обоснована и экспериментально подтверждена возможность расширения сырьевой базы тимьянов и создание на их основе фитопрепаратов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты

проведения химического анализа, фармакологических, технологических исследований показывают перспективу внедрения в официнальную медицину растительного сырья изученных видов тимьяна наряду с тимьяном ползучим, что приведет к расширению номенклатуры растительного сырья за счет применения близкородственных видов.

Результаты проведенного фитохимического анализа расширят сведения о химическом составе растений рода тимьян.

Разработана и апробирована спектрофотометрическая методика определения суммы флавоноидов в перерасчете на цинарозид и суммы

13

гидроксикоричных кислот в перерасчете на розмариновую кислоту.

Установлены валидационные характеристики разработанных методик.

Проведена стандартизация цельного, измельченного и порошкованного сырья травы тимьяна ползучего и тимьяна Маршалла.

Результаты морфолого-анатомических исследований позволили установить макроскопические и микродиагностические признаки, которые в дальнейшем рекомендованы для определения подлинности измельченного и порошкованного сырья чабреца, включенные в проект ФС «Чабреца трава».

Внедрение в практику. Проведенные исследования позволили

разработать и утвердить:

-фармакопейную статью «Чабреца трава», включенную в Государственную фармакопею России XIII издания;

-«Инструкцию по сбору и сушке травы чабреца (тимьяна ползучего)»,

рассмотренную и утвержденную комиссией по стандартизации ВИЛАР;

- разработан проект нормативного докумена «Тимьяна Маршалла трава», который согласован и апробирован на ООО Фирма «Здоровье».

Разработанные в результате проведенных исследований методики апробированы и внедрены в работу ООО Фирма «Здоровье»: «Методика качественного обнаружения флавоноидов методом ТСХ в сырье «Чабреца трава», «Методика качественного обнаружения эфирного масла методом ТСХ в сырье «Чабреца трава», «Методика количественного определения суммы флавоноидов в траве чабреца».

Фрагменты настоящего диссертационного исследования находят применение в научной и учебной работе кафедры фармакогнозии Пятигорского филиала ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет», фармацевтического факультета «Северо-

Осетинского государственного университета им. К.Л. Хетагурова».

14

Научные исследования, проведенные в ходе выполнения диссертационной работы, включены в монографию В.Н. Бубенчиковой,

Ю.А. Старчак «Тимьяны флоры Центрального Черноземья».

Методология и методы исследования. Методологической основой исследования является поиск и анализ литературных данных на основе филогенетического родства по выбору объектов исследования, требующих расширения сырьевой базы; изученность их химического состава и фармакологических свойств, применения в народной медицине, ресурсная база; постановка целей и задач по экспериментальному обоснованию их практического использования, изучение химического состава и фармакологических свойств, стандартизация сырья, разработка нормативной документации на растительное сырье, обобщение материалов в виде выводов, определяющих теоретическое и практическое значение диссертационной работы.

При выполнении фармакогностического исследования применяли физико-химические (УФ-спектроскопия, ИК-спектроскопия, ВЭЖХ,

газожидкостная хромато-масс-спектрометрия), химические,

фармакологические, макро- и микроскопические, а также статистические методы анализа.

Положения, выносимые на защиту:

-теоретическое обоснование и экспериментальное подтверждение расширения ресурсной базы тимьянов для получения фитопрепаратов;

-результаты исследования состава биологически активных веществ 7

видов тимьяна;

-результаты изучения фенольных соединений и тритерпеновых соединений, методы их выделения и идентификации;

-результаты сравнительного морфолого-анатомического изучения тимьянов флоры средней полосы России;

-результаты фармакологических исследований;

15

-результаты разработки методик анализа, характеристик качества сырья тимьянов;

-результаты совершенствования технологии жидкого экстракта тимьяна ползучего.

Степень достоверности. Научные положения, выводы диссертационной работы основываются на большом объеме экспериментального материала, полученного с использованием современных методов исследования, что подтверждается большим количеством таблиц,

рисунков, схем хроматограмм. Все результаты исследований обработаны статистически в соответствии с требованиями ГФ XI с помощью программы

«Microsoft Excel». Различия между группами считались статистически значимыми при P 0,05. Разработанные методики количественного определения валидированы.

Апробация результатов. Основные положения диссертации доложены

иобсуждены на: Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Традиции и инновации фармацевтической науки

ипрактики», посвященная 45-летию фармацевтического факультета КГМУ

(27 октября 2011 г., КГМУ, г. Курск); III, IV международных научно-

практических конференциях «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (г. Владикавказ, 2012 г., 2013 г.); II Международном конгрессе «Физическое и духовное здоровье: традиции и инновации» (7-10

июня 2012 г., г. Москва); II международной научно-практической

конференции «Современные проблемы медико-биологической и

фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области» (9-10 ноября 2012 г., г. Пенза); XX, XXI XXII, XXIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г.

аспекты» г. Москва 2012 г., 2015 г.); международной конференции «Свободные радикалы в химии и жизни» (25-26 июня 2015 г., г. Минск).

Связь темы исследований с планом научных работ.

Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» по теме «Изучение лекарственных областей Центральной России и вопросы их рационального использования» (номер государственной регистрации № 01201460860).

Публикации. По результатам диссертационной работы были опубликована 61 работа, в том числе 23 статьи в журналах перечня ВАК Министерства образования и науки РФ; 1 патент РФ на изобретение «Способ получения олеаноловой кислоты» №2538213, опубл. 10.01.15., Бюл. №1, 1 монография «Тимьяны флоры Центрального Черноземья». Опубликована 1

фармакопейная статья «Чабреца трава» в Государственной фармакопеи РФ

XIII издания.

Личный вклад автора. Автором лично выбраны объекты исследования, направление исследований, поставлены цели и задачи исследования. Автором проведен научно-информационный поиск, проведены экспериментальные исследования. В сборе и обобщении полученных результатов доля автора является определяющей.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности.

Диссертационная работа соответствует паспорту специальности 14.04.02-

фармацевтическая химия, фармакогнозия, конкретно пунктам 3, 5, 6, 7.

Работа представляет итог исследований, выполненных автором в сотрудничестве с кафедрой общей и фармацевтической химии Орловского государственного университета, кафедрами фармакогнозии и ботаники, микробиологии, вирусологии и иммунологии, НИИ экологической медицины Курского государственного медицинского университета,

17

Национальным фармацевтическим университетом Министерства охраны здоровья Украины, а также в сотрудничестве с центром контроля качества и сертификации лекарственных средств центра обеспечения медицинской техникой и имуществом министерства обороны Российской Федерации.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа включает введение, обзор литературы (глава 1), материалы и методы исследования

(глава 2), четыре главы экспериментальных исследований, заключение,

выводы, список литературы, приложения. Диссертация размещена на 470

страницах печатного текста, где имеется 75 таблиц, 234 рисунка. Список литературы содержит 349 литературных источников, 63 из них иностранных авторов.

18

ГЛАВА 1 РАСТЕНИЯ РОДА ТИМЬЯН КАК ИСТОЧНИКИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

1.1Ботаническая характеристика растений рода тимьян флоры средней полосы России

Род тимьян - Thymus L. – принадлежит к семейству Яснотковые

(Lamiaceae) и включает несколько сотен видов, распространѐнных почти по всей Евразии (кроме тропиков), в Северной Африке, на Канарских островах и доходящих на Северо-западе до Гренландии [267].

Род Thymus L. – один из наиболее крупных в семействе Lamiaceae. Во флоре СССР он представлен 136 видами [267].

В областях Средней полосы России произрастает 7-8 видов тимьянов

[266, 268], относящееся к 2 секциям и 4 подсекциям:

Секция 1 Camptodromi A. Kern.

19

Жизненная форма растений рода тимьян - полукустарнички, с

лежачими или восходящими, одеревеневшими стеблями (стволиками) и

прямостоящими или приподнимающими травянистыми цветоносными ветвями, часто с лежачими бесплодными побегами, заканчивающими ползучими стволиками или отходящими сбоку от стволиков, реже без них.

Листья весьма разнообразные по форме, величине и характеру жилкования,

черешковые или реже сидячие, цельнокрайние или иногда зазубренные

(постоянный признак у некоторых дальневосточных видов), по краю почти всегда, по крайней мере у основания, с ресничками. Прицветные листья сходные со стеблевыми или резко от них отличающиеся (в секции

Subbracteatae Klok.), прицветники мелкие, линейно-ланцетные. Соцветие головчатое или удлинѐнное и прерванное, цветки в ложных мутовках.

Чашечка с цилиндрической или колокольной трубкой с 10(13)

жилками; нижняя губа до основания двураздельная, с узкими яйцевидными,

всегда реснитчатыми долями; верхняя - широкая, отклоненная, до 1/3 – 1/2

трѐхлопастная, с ланцетными или треугольными зубчиками, по краю реснитчатыми или покрытыми мелкими щетинками, реже гладкими; зев чашечки при основании отгиба ограничен венцом из прямых щетинистых волосков. Венчик с короткой или более удлинѐнной трубкой и двугубым отгибом, лиловый, розовый или белый; верхняя губа на верхушке выемчатая,

нижняя трѐхлопастная, отклонѐнная. Тычинки в числе четырех,

прямостоящие, от основания расходящиеся; пыльники двугнѐздные, с

довольно широким связником, столбик с шиловидными лопастями; плодики

(орешки) эллипсоидальные или почти шаровидные [267].

Секция 1 Camptodromi A. Kern. Подсекция 1 Isolepides:

Тимьян Палласа (Thymus Pallasianus H. Braun) - многолетний

полукустарничек, с толстоватыми стволиками, заканчивающимися плодущими побегами, и с довольно короткими, немногочисленными стелющимися бесплодными побегами, отходящими от стволиков.

20