Фармакогностическое изучение растений рода тимьян (Thymus L.) как перспективного источника получения фитопрепаратов

УФ-спектр вещества 3.17 показывает максимумы поглощения в области

257, 267, 345 нм (таблица 11). Наличие двух максимумов поглощения в коротковолновой области свидетельствует о гидроксилировании кольца В,

чаще всего в положении 3', 4'. Батохромный сдвиг в длинноволновой области спектра отсутствует при добавлении натрия ацетата и борной кислоты, что говорит о том, что одна из гидроксильных групп либо отсутствует в положениях С-3' или С-4' или замещена метоксильной группой. Батохромный сдвиг максимума длинноволновой полосы при взаимодействии с натрия ацетатом на 20 нм говорит о наличии гидроксильной группы в 7 положении.

Батохромный сдвиг максимума длинноволновой полосы с циркония оксихлоридом на 45 нм говорит о свободной оксигруппе у С-5 [148].

С16Н12О6

Рисунок 39– Структурная формула и УФ – спектр вещества 3.17

ИК–спектр вещества 3.17 показывает полосы поглощения, характерные для фенольных ОН-групп (3340 см-1), карбоксила γ-пиронового цикла (1660 см- 1), 1510, 1568, сопряженных С=С-связей (1600-1615 см-1) [34, 35, 233].

При щелочной деструкции вещества 3.17 образовалась изованилиновая кислота и флороглюцин. При ацетилировании получали триацетат. При деметилировании вещества 3.17 получали лютеолин. При смешивании вещества 3.17 и известного образца диосметина не наблюдали депрессии температуры плавления. Проведенные исследования позволили охарактеризовать вещество 3.17 как 5,7,3'-тригидрокси-4'-метоксифлавон или диосметин [1].

Вещество 3.18 – кристаллы светло-желтого цвета. Т.пл. 331-332 С

таблица 9).

151

УФ-спектр вещества 3.18 демонстрирует максимумы поглощения в области 255, 265, 350 нм (таблица 11). На основании батохромного сдвига максимума длинноволновой полосы на 45 нм при взаимодействии с натрия ацетатом установлена свободная оксигруппа у С-7, а батохромного сдвига на 55

нм с натрия гидроксидом свободная 4 - гидроксильная группа. При взаимодействии с циркония оксихлоридом наблюдается батохромный сдвиг максимума длинноволновой полосы на 50 нм, что показывает свободную оксигруппу у С-5. Данный комплекс при прибавлении кислоты лимонной разрушается [148].

С16 Н12О6

Рисунок 40 – Структурная формула и УФ – спектр вещества 3.18

Метоксильная группа в положении С-3 обнаружена на основании отсутствия батохромного сдвига при взаимодействии с кислотой борной и натрия ацетатом [148].

ИК-спектр вещества 3.18 имеет полосы поглощения, характерные для фенольных оксигрупп (3400-3520 см-1 ), карбонильной группы -пирона (1650

см-1), колебаний ароматических колец (1610, 1560, 1510 см-1), метоксильных групп (2845-2945 см-1) [34, 35].

При щелочном расщеплении вещества 3.18 идентифицированы флороглюцин и изованилиновая кислота. При ацетилировании вещества 3.18

получали его триацетат.

При дезметилировании вещества 3.18 получали лютеолин. Проведенные исследования позволили охарактеризовать вещество 3.18 как 5,7, 4 - триокси,

3 - метоксифлавон или хризоэриол [43, 213].

152

Вещество 3.19 – кристаллический порошок светло-желтого цвета. Т.пл.

260-262 С (таблица 9).

Характер УФ-спектра метанольного раствора вещества 3.19 позволяет отнести его к 5,7-диоксифлавонам. УФ-спектр имеет интенсивный максимум поглощения в области 275 нм, а длинноволновый максимум выражен слабо, что говорит о том, что вещество 3.19 является В-незамещенным (таблица 11).

Батохромный сдвиг максимума I полосы на 50 нм при взаимодействии с натрия ацетатом обнаруживает свободную оксигруппу у С-7. С натрия гидроксидом в метиловом спирте у вещества 3.19 проявляется гипсохромный сдвиг по сравнению с батохромным сдвигом, вызванным натрия ацетатом, что обусловлено легкостью окисления виценальной триоксигруппировки в щелочной среде. Батохромный сдвиг на 40 нм при взаимодействии с циркония гидроксихлоридом выявляет свободную 5-оксигруппу. Свободная оксигруппа в

6 положении, дополнительная к 7-оксигруппе обнаруживается в УФ-спектре борного комплекса, ионизированного натрия ацетатом, а также по дифференциальному УФ-спектру цирконильного комплекса на фоне комплекса

5-оксифлавоноидов. 6-оксифлавоноиды отличаются также небольшим расстоянием между максимумами А и В, которое равно 50 нм. Таким образом,

установлена 6,7-диоксигруппировка в веществе 3.19 [148].

С15Н10О5

Рисунок 41 – Структурная формула и УФ – спектр вещества 3.19

ИК-спектр вещества 3.19 показывает полосы поглощения, характерные для фенольных оксигрупп (3500-3100 см-1), С=0 γ-пирона (1665-1655 см-1), С=С

ароматического кольца (1625-1440 см-1), В-незамещенное кольцо (726-680 см-1) [34, 35, 233].

153

Рисунок 42 - ИК - спектр вещества 3.19

При щелочном плавлении вещества 3.19 идентифицировали бензойную кислоту, а фенол, образующийся из А кольца вероятно разрушается. При ацетилировании получали триацетат.

Проведенные исследования позволили охарактеризовать вещество 3.19

как 5,6,7-триоксифлавон или байкалеин [1, 150].

Флавоноидные гликозиды

Вещества 3.20-3.22 отнесены к флавоноидным гликозидам на основании положительной цианидиновой реакции и при этом образуются красные пигменты, которые не переходят в слой октанола. Восстановление жидкости Фелинга происходит только после проведения предварительного гидролиза

[141, 292, 304].

Вещества 3.20-3.22 отнесены к моногликозидам флавоноидов на основании данных молекулярной массы (таблица 9), количественного соотношения агликона (61,3) и сахарного компонента, а также соотношения в УФ-спектрах интенсивностей поглощения максимумов длинноволновой полосы гликозида и агликона (60%) [145, 148, 159].

Вещество 3.20 – кристаллический порошок светло-желтого цвета. Т.пл.

256-258С (таблица 9).

154

Таблица 12 - УФ-спектральная характеристика О-гликозидов флавоноидов, нм

После проведения кислотного гидролиза 10% кислотой хлористоводородной в 50% кислоте уксусной, в течение 2 часов был получен и идентифицирован агликон лютеолин (вещество 3.11) и D – глюкоза.

УФ-спектр вещества 3.20 характеризуется максимумами поглощения в области 255, 266 и 350 нм (таблица 12). Спектральными исследованиями в УФ-

области спектра и качественными реакциями установили, что в веществе 3.20

имеются свободные оксигруппы в 5, 3´, 4´- положениях, а углеводный компонент присоединяется по С-7 (отсутствие батохромного сдвига с натрия ацетатом) [148].

HO

OH O

С12Н20О11

Рисунок 43 – Структурная формула и УФ – спектр вещества 3.20

ИК-спектр вещества 3.20 показывает полосы поглощения, характерные для спиртовых оксигрупп углеводов (3430 см-1), карбонильной группы -пирона

(1660 см-1), колебаний ароматических колец (1600-1450 см-1) [34, 35, 233].

155

Рисунок 44 - ИК спектр вещества 3.20

Метод дифференциальной спектроскопии в ИК-области показал наличие трех полос поглощения, подтверждающих пиранозную форму сахара (1100-

1010 см-1), а полоса при частоте 890 см-1 указывает на -гликозидную связь -

пиранозидов [34, 35, 233]. При смешении вещества 3.20 и стандартного образца цинарозида (Фитопанацея) не наблюдали депрессии температуры плавления.

Проведенные исследования позволили вещество охарактеризовать вещество 3.20 как лютеолин–7–О– –D–глюкопиранозид или цинарозид [43, 150].

Вещество 3.21 - мелкий кристаллический порошок желтовато-белого цвета. Т.пл. 225-227 0С (таблица 9).

При проведении кислотного гидролиза кислотой хлористоводородной 10%

в кислоте уксусной 50% в течении 2-х часов был получен и идентифицирован агликон апигенин (вещество 3.10) и D-глюкоза.

УФ-спектр вещества 3.21 демонстрирует максимумы поглощения в области 335 и 270 нм (таблица 12). Спектральными исследованиями в УФ-

области спектра установлено, что в веществе 3.21 имеются свободные оксигруппы в 5,4´-положениях, а углеводный заместитель присоединяется у С-

7 (отсутствие батохромного сдвига с натрия ацетатом) [148].

156

С21Н20О10

Рисунок 45 – Структурная формула и УФ – спектр вещества 3.21

Флавоноидная природа вещества 3.21 подтверждается ИК-спектром,

имеющим полосы поглощения, характерные для спиртовых оксигрупп углеводов (3400-3300 см-1), фенольных оксигрупп (2900 см-1), карбонильной группы γ-пирона (1660 см-1), валентных колебаний ароматических колец (1610-

1430 см-1) [34, 35, 233].

Метод дифференциального анализа в ИК области спектра показал наличие трех полос поглощения, характеризующих пиранозную форму глюкозы (1100-1010 см-1), а полоса поглощения при 890 см см-1 характеризует

β-гликозидную связь пиранозидов [34, 35, 233].

Проба смешения вещества 3.21 и известного образца космоссиина не давала депрессии температуры плавления.

Проведенные исследования позволили охарактеризовать вещество 3.21

как апигенин -7-О-β-D-глюкопиранозид или космоссиин [201].

Вещество 3.22 – кристаллический порошок желтоватого цвета. Т.пл. 225227 0С (таблица 9).

УФ-спектр вещества демонтирует максимумы поглощения в области 285

и 335 нм (таблица 12). Отсутствие батохромного сдвига вещества 3.22 с натрия ацетатом позволило предположить, что углеводный заместитель присоединяется по положению С-7 [148].

157

Рисунок 46 – Структурная формула и УФ – спектр вещества 3.22

Флавоноидная природа вещества 3.22 подтверждается ИК-спектром,

имеющим полосы поглощения, характерные для спиртовых оксигрупп углеводов (3400-3300 см-1), фенольных оксигрупп (2900 см-1), карбонильной группы γ-пирона (1660 см-1), валентных колебаний ароматических колец

(1610-1430 см-1) [34, 35, 233].

Метод дифференциального анализа в ИК области спектра показал наличие трех полос поглощения, характеризующих пиранозную форму сахара

(1100-1010 см-1), а полоса поглощения при 890 см-1 характеризует β-

гликозидную связь пиранозидов [34, 35, 233].

Рисунок 47 - ИК спектр вещества 3.22

Положение углеводного заместителя устанавливали проведением его метилирования с последующим кислотным гидролизом и идентификацией продуктов реакции. Подтвердили, что углеводный заместитель присоединяется

158

в положении С-7, его идентификацию проводили с помощью качественной реакции на уроновую кислоту (к водной суспензии прибавляли 2-3 капли 1%

раствора γ-нафтола и наслаивали 2-3 мл концентрированной кислоты серной, на границе слоев образовывалось красное окрашивание, переходящее в зеленое).

Для выделения и идентификации глюкуроновой кислоты использовали глюкуронидозу свежих корней шлемника байкальского, с последующей сравнительной хроматографией на бумаге в системе растворителей н. бутанол-

кислота уксусная-вода (4:1:2); в качестве проявителя выступал анилингидрофталат. Вещество легко расщеплялось β-глюкуронидозой, что свидетельствует о β-глюкопиранозном характере углеводного остатка [150].

Проведенные исследования позволили охарактеризовать вещество 3.22

как скутеллареин-7-О-β-D-глюкуронид или скутелларин [1].

Дубильные вещества

Качественный анализ

При проведении качественных реакций на дубильные вещества образовывалось помутнение в реакции со свежеприготовленным раствором желатина 1% и раствором кислоты хлористоводородной 10%; реакция с раствором формальдегида и кислоты хлористоводородной приводила к образованию кирпично-красных осадков; реакция с бромной водой давала образование осадка; с раствором железоаммонийных квасцов 1% наблюдали образование черно-зеленого окрашивания. Результаты качественных реакций позволили установить в сырье исследуемых растений преимущественное наличие дубильных веществ конденсированной группы.

Количественный анализ

Содержание дубильных веществ, определенное фармакопейным перманганатометрическим методом [83] показало, что содержание их в траве растений рода тимьян колеблется от 12,04±0,20% (тимьян двуликий) до

22,68±0,30% (тимьян блошиный) (таблица 13). Однако, фармакопейный метод не позволяет объективно оценивать содержание дубильных веществ в

159

лекарственном растительном сырье, особенно при содержании около 10% и

менее, так как значительно возрастает ошибка за счѐт способности калия перманганата окислять и другие биологически активные вещества,

содержащиеся в траве растений рода тимьян и относящиеся по химическому строению к различным классам биологически активных веществ. На точность результатов влияет также пересчѐтный коэффициент, различный для разных групп фенольных соединений и растений, нечѐткий переход окраски при титровании, степень разведения титруемых растворов и т.д. Поэтому для объективной оценки качества сырья растений рода тимьян по содержанию дубильных веществ нами использован и комплексонометрический метод 81, 140 . Выбор этого метода обоснован тем, что он позволяет проводить определение дубильных веществ в присутствии полифенольных и других сопутствующих веществ. Данный метод основан на способности дубильных веществ осаждаться солями тяжѐлых металлов. Он заключается в том, что дубильные вещества осаждаются цинка аммиачным раствором, далее осадок выделяется центрифугированием, комплекс цинк – дубильные вещества разрушается кислотой с последующим титрованием выделившихся катионов цинка раствором трилона Б в присутствии индикатора ксиленового оранжевого81 .

Определение оптимальных условий экстракции дубильных веществ проводили на одном образце тимьяна Маршалла, как наиболее распространѐнного в областях Средней полосы Европейской части России в сравнении двумя методами: перманганатометрическим и комплексонометрическим.

При этом изучены следующие стадии: экстрагирование суммы дубильных веществ, очистка полученного комплекса цинк-дубильные вещества.

При проведении количественного анализа природных биологически активных веществ, в том числе и дубильных веществ наиболее важной

продолжительной стадией является процесс экстрагирования. Процесс

160