Фармакогностическое изучение растений рода тимьян (Thymus L.) как перспективного источника получения фитопрепаратов

них 7 фенолокислот, 5 оксикоричных кислот, 11 флавоноидных соединений

(таблица 8).

В траве тимьяна Палласа определено 11 фенольных веществ, из них впервые 9: 5 фенолокислот, 2 оксикоричные кислоты, 2 флавоноида; в траве тимьяна мелового определено - 13 (10 из них впервые: 6 фенолокислот, 1 оксикоричная кислота, 3 флавоноидных соединения); в траве тимьяна

определено - 14 (7 из них впервые: 6 фенолокислот и 1 флавоноид); в траве тимьяна Маршалла определено - 15 (12 – впервые: 6 фенолокислот, 2 оксикоричные кислоты, 4 флавоноида); в траве тимьяна двуликого определено - 14 (10 – впервые: 6 фенолокислот, 2 оксикоричные кислоты, 2 флавоноида); в траве тимьяна Черняева определено - 12 (12 – впервые: 7 фенолокислот, 4 оксикоричные кислоты, 1 флавоноид).

121

122

Рисунок 19 – Хроматограмма результатов ВЭЖХ анализа фенольных соединений сырья тимьяна Палласа

123

Рисунок 20 – Хроматограмма результатов ВЭЖХ анализа фенольных соединений сырья тимьяна ползучего

Рисунок 21 – Хроматограмма результатов ВЭЖХ анализа фенольных соединений сырья тимьяна Черняева

124

Методами высокоэффективной и газожидкостной хроматографии определено содержание фенольных веществ в исследуемых видах тимьянов.

Подтверждены результаты хроматографического анализа, что из оксикоричных кислот во всех видах преобладает розмариновая кислота. Ее содержание варьирует от 2343,40 мг/кг (тимьян двуликий) до 14351,74 мг/кг (тимьян блошиный). Среди флавоноидов преобладает цинарозид (лютеолин-7-

глюкозид) содержание, которого колеблется от 586,39 мг/кг (тимьян меловой)

до 1564,59 мг/кг (тимьян блошиный). Данные соединения являются маркерами растений рода тимьян и их можно использовать для целей количественного анализа.

3.2.2 Выделение фенольных соединений

С целью подтверждения хроматографического анализа были выделены и исследованы фенольные соединения. Препаративно фенольные соединения выделяли из высушенного растительного сырья (трава), измельченного в порошок вальцеванием с размером частиц менее 1 мм. Для экстрагирования и выделения фенольных веществ перерабатывали от 100,0 г до 1,0 кг сырья растений рода тимьян. Экстракцию сырья проводили спиртом 96%, водно-

спиртовыми смесями и водой очищенной.

Выделение флавоноидных агликонов до и после проведения кислотного

гидролиза

Выделение флавоноидных агликонов до гидролиза проводили на примере травы тимьяна блошиного. Экстракцию флавоноидных агликонов проводили методом фильтрационной экстракции спиртом этиловым 70% из тонкоизмельченного высушенного сырья (300,0 г). Получали 1,8 л извлечения.

Полученное водно-спиртовое извлечение упаривали до водного остатка,

охлаждали, фильтровали. Очищенное водное извлечение обрабатывали 6-ти

125

кратно равными объемами диэтилового эфира. Полученное эфирное извлечение упаривали досуха и использовали для выделения флавоноидных агликонов.

После проведения хроматографии на бумаге в сухом остатке эфирного извлечения были обнаружены вещества 3.10, 3.11, 3.17. Для выделения индивидуальных веществ использовали колоночную хроматографию на полиамидном сорбенте (колонка 2х30 см, полиамидный сорбент в виде суспензии в спирте изопропиловом.

Для этого сухой остаток эфирной фракции (0,36 г) растворяли в 40 мл спирта изопропилового и наносили на подготовленную колонку с полиамидным сорбентом. После того, как раствор осадка войдет в колонку, в

колонку добавляли изопропиловый спирт, которым промывали колонку,

собирая фракции по 50 мл. В полученных фракциях анализировали состав флавоноидов хроматографией на бумаге, которая была импрегнирована формамидом, в системе растворителей: бензол-этилацетат-кислота уксусная

(50:50:1). Во фракциях 7-16 содержались вещества 3.21, 3.20, фракции 17-23 -

вещество 3.20, фракции 23-36 - смесь веществ 3.20 и 3.11, фракции 37-45 -

смесь веществ 3.11, 3.17.

Фракции, в которых содержались индивидуальные вещества (17-23),

объединяли, упаривали в вакууме и кристаллизовали из спирта этилового 50%.

В результате получали вещество 3.20 (86 мг).

Смесь веществ 3.20 и 3.11, 3.11 и 3.17 разделяли, используя повторную хроматографию на колонке с полиамидным сорбентом. Элюэнтом служил хлороформ и смесь хлороформа со спиртом, при увеличении концентрации последнего. В итоге выделили вещества 3.11 (137 мг), 3.17 (98 мг).

Очищенное водное извлечение после отделения агликонов подвергали гидролизу кислотой хлористоводородной 10% в кислоте уксусной 50% в

течение 2-х часов. Полученные агликоны из гидролизатов извлекали эфиром диэтиловым. Эфирное извлечение упаривали досуха и использовали для выделения агликонов после кислотного гидролиза.

126

В составе сухого остатка эфирного извлечения из травы тимьяна блошиного хроматографией на бумаге в системе растворителей бензол-

этилацетат-кислота уксусная (50:50:1), были найдены вещества 3.10 и 3.11. Для их выделения сухой остаток эфирной фракции растворяли в 30 мл спирта метилового, смешивали с 10,0 г полиамидного сорбента, далее сорбент высушивали на воздухе при температуре 22-250С. Для разделения флавоноидных агликонов, полученных после кислотного гидролиза использовали полиамидный сорбент (колонка 2х40 см, суспензия полиамида в хлороформе). Сумму агликонов разделяли, используя смесь хлороформ-спирт этиловый (9:1, 8:2), при этом выделили вещество 3.11 (118 мг) из фракций 5-12

и вещество 3.10 (56 мг) из фракций 16-21.

Выделение оксикоричных кислот и флавоноидных моногликозидов

Для выделения и разделения оксикоричных кислот и флавоноидных гликозидов проводили экстракцию растительного сырья тимьяна двуликого

(500 г) 70% спиртом этиловым методом фильтрационной экстракции.

Полученное водно-спиртовое извлечение (3,0 л) упаривали до водного остатка,

фильтровали для удаления хлорофилла и обрабатывали 6 раз равными объемами этилацетата. Объединенные этилацетатные извлечения упаривали под вакуумом до смолообразного остатка. К полученному остатку приливали минимальное количество спирта метилового при нагревании для растворения.

Полученный раствор быстро охлаждали и смешивали при перемешивании с избытком эфира диэтилового, при этом выпадал осадок, в составе которого хроматографически обнаружены вещества 3.13, 3.17, 3.19, 3.21.

Осадок отделяли и использовали для выделения агликонов и флавоноидных моногликозидов. Разделение обнаруженных веществ осадка проводили хроматографией на колонках с полиамидным сорбентом (диаметр колонки 2,5 смх40 см; суспензия полиамида в спирте этиловом). Полиамидный сорбент смешивали со спиртом этиловым 96% и вносили полученную

127

суспензию в колонку. Далее брали 20 мл спирта этилового 70%, растворяли в нем осадок этилацетатной фракции и полученный раствор смешивали с полиамидным сорбентом (10 г), который высушивали на воздухе. Высушенный с осадком полиамидный сорбент смешивали со спиртом этиловым 96% и

вносили в виде суспензии в подготовленную колонку. Колонку промывали спиртом этиловым 96% и далее спирто-водными смесями (5%, 10% и т.д.).

Собирали фракции по 50 мл. Состав флавоноидов в полученных фракциях анализировали, используя хроматографию на бумаге в системе растворителей:

кислота уксусная 15% и бензол-этилацетат-кислота уксусная (50:50:1) на бумаге, импрегнированной формамидом. Фракции 23-57 содержали смесь веществ 3.12 и 3.13, фракции 61-69 вещество 3.20. Фракции 61-69 объединяли,

упаривали и кристаллизовали из спирта этилового 96%. В результате выделили вещество 3.20 (43 мг). Фракции 23-57, содержащие вещества 3.12 и 3.13

объединяли и использовали для хроматографии на бумаге в системе растворителей кислота уксусная 30%. Пятна веществ 3.12 и 3.13 вырезали,

проводили их элюированием спиртом этиловым 90% и упаривали до минимального объема. В итоге препаративно выделили вещества 3.12 и 3.13.

Эфирно-метанольный раствор, содержащий вещества 3.06, 3.07, 3.08,

использовали для выделения оксикоричных кислот. Для этого упаривали под вакуумом при комнатной температуре для удаления эфира до образования сиропообразного остатка. Полученный остаток смешивали с силикагелем и наносили на подготовленную хроматографическую колонку с силикагелем в хлороформе (высота колонки 50 см, диаметр 4 см). Элюирование вели смесью хлороформ-спирт этиловый 96% в соотношении 90:10, 80:20, собирая фракции по 50 мл. Анализ полученных фракций проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинках Sorbfil в системе растворителей: хлороформ-

спирт метиловый-вода очищенная (26:14:3). Фракции 7-18 содержали вещество

3.06, фракции 19-26 смесь веществ 3.06 и 3.07, а начиная с 27 фракции в элюатах появляется вещество 3.09 с примесями веществ 3.06, 3.07.

130