Лабораторная работа количественное определение активности амилазы (диастазы) в моче (по вольгемуту)

Цель занятия: уметь повести количественное определение амилазы в моче для диагностики почечной недостаточности и заболевания поджелудочной железы.

Механизм действия амилазы.

В активном центре амилазы на гликозидную связь действуют карбоксильная группа дикарбоновых аминокислот, а с противоположной стороны остаток гистидина, который предварительно протонизируется карбоксильной группой.

Таким образом первичный субстрат-энзимный комплекс (SE) образуется за счет действия отрицательно заряженного кислорода карбоксильной группы на С₁остатка глюкозы, имеющего частично положительный заряд. С другой стороны, протонизированный (NH⁺) остатка гистидина притягивается кислородом гликозидной связи. В результате такого действия растягивается и разрывается связь между С₁ и О. Комплекс переходит свою активную стадию S^E, причем левая часть полиглюкозида уходит в свободном виде и представляет собой одним из продуктов реакции Р₁. На освободившееся место приходит молекула воды и вновь образуются слабые взаимодействия между кислородом воды и С₁, который опять же имеет частично положительный заряд, так как соединен с двумя атомами кислорода. С другой стороны, азот гистидина протонизируется за счет водорода воды. Сейчас растягивается и разрывается связь между Н и ОН, т. е. идет гидролиз, а фермент амилаза только катализирует этот гидролиз. В результате S^E распадается с образованием второй части полиглюкозидной цепи (Р₂). В результате восстанавливается структура активного центра фермента и он готов к осуществлению следующего каталического акта в гидролизе гликозидной связи.

Порядок выполнения работы: в 10 пронумерованных пробирок приливают по 1 мл 0,85% раствора хлористого натрия. В первую пробирку приливают 1 мл исследуемой мочи, перемешивают, втягивая смесь пипеткой и вновь выпуская ее в пробирку, 1 мл смеси переносят во вторую пробирку и т.д., выливая из десятой пробирки 1 мл смеси.

В каждую пробирку приливают по 2 мл 0,1% раствора крахмала и по 1 мл 0,85% раствора хлористого натрия, перемешивают и опускают на 15 минут в водяную баню или термостат при температуре 45^оС. После охлаждения пробирок холодной водой, в каждую пробирку по 1 капле раствора йода в йодистом калии. Рассчитывают активность диастазы мочи.

Гидролиз крахмала в присутствии диастазы мочи при различном ее разведении.

№ пробирки	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Разделение мочи	1/2	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64	1/128	1/256	1/512	1/1012
Окраска йода
Вывод о течении реакции

Расчет. Рассчитывают количество мочи в последней пробирке с желтоватой окраской. Если моча в ней, например, была разведена в 8 раз, составляют следующую пропорцию: находят при этом амилолитическую силу мочи: