Механизм действия фермента условно происходит по следующей схеме

где E — фермент; S — субстрат; P — продукт реакции.

Ферментативный процесс – кооперативный процесс, который состоит из целого ряда элементарных, основанных на низких энергетических уровнях взаимодействий с образованием слабых водородных, гидрофобных и других межрадикальных связей.

Исходя из графика видно, что ферментативные реакции происходят при более низкой энергии активации данной реакции, поэтому ферменты и являются катализаторами.

Это объясняет высокую активность действия ферментов при физиологических значениях рН и температуры, по сравнению с минеральными катализаторами. Следовательно, ферменты являются катализаторами, так как снижают энергию активацию реакции.

Помимо активного центра, в структуре ферментов имеются и аллостерические центры, куда могут присоединятся эффекторы – меняющие пространственную структуру фермента, она может меняться в лучшую сторону (активаторы ферментов) или активный центр нарушает свою структуру (ингибиторы ферментов).

Ингибиторы способны связываться с ферментами с разной степенью прочности.

Обратимые ингибиторы связываются с ферментом слабыми не ковалентными связями и при определенных условиях легко отделяются от ферментов, E + I ↔ EI,

По механизму действия обратимые ингибиторы подразделяются на конкурентные и неконкурентные. Конкурентное ингибирование наблюдается, когда ингибитор является структурным аналогом субстрата. При повышении концентрации субстрата скорость ферментативной реакции не изменяется, то есть ингибирование ослабляется.

Многие лекарственные препараты оказывают свое терапевтическое действие по механизму конкурентного ингибирования.

Например, четвертичные аммониевые основания ингибирует ацетилхолин эстеразу, катализирующую реакцию гидролиза ацетилхолина:

Эффективные антихолинэстеразные препараты – прозерин, эндрофоний и др.:

При добавлении ингибиторов активность холинэстеразы уменьшается, количество нейромедиатора (субстрата) увеличивается, поэтому прозерин и эндрофоний используется для лечения мышечных дистрафий.

Неконкурентным обратимым называют такое ингибирование реакции при котором ингибитор взаимодействует с ферментом в участке отличным от активного центра. Например, ионы тяжелых металлов взаимодействуют чаще всего с –SH группой молекулы белка нарушая конформацию фермента, тем самым препятствуя катализу. При повышении концентрации субстрата ослабляется ингибирование.

Такие ингибиторы изменяют их активность, что является одним из способов регуляции ключевых процессов, протекающих в организме. Например, гем – аллостерический ингибитор первого фермента начальной стадии его синтеза.

В тоже время является аллостерическим активатором транскрипции α- и β-цепей гемоглобина.

Необратимые ингибиторы образуют ковалентные связи с активном центром фермента, в результате чего подавляется каталитическая функция ферментов. Такие ингибиторы называют специфическими, которые действуют на определенную группу аминокислоты активного центра (ОН-группа серина).

Фермент антитрипсин ингибирует все сериновые протеазы. При панкреатите происходит преждевременное активация трипсина. Активный трипсин вызывает протеолиз белков ткани поджелудочной железы. При лечении панкреатита используют трасилол, являющийся конкурентным ингибитором трипсина. Необратимые неспецифические ингибиторы (Н₂S, соли свинца, ртути) необратимо изменяют конформацию всей молекулы фермента. Необратимые специфические ингибиторы (Н₂S, соли свинца, ртути) необратимо изменяют конформацию всей молекулы фермента.

На скорость ферментативной реакции влияет и концентрация субстрата. Если концентрацию фермента оставить постоянной, изменяя только количество субстрата, то график скорости ферментативной реакции описывается гиперболой.

При увеличении количество субстрата начальная скорость возрастает, когда фермент полностью насыщен субстратом, т. е. происходит максимально возможное формирование фермент субстратных комплексов наблюдается наибольшая скорость образования продукта. Дальнейшее повышение концентрации субстрата не ведет к возрастанию скорости ферментативной реакции. Данная состояние соответствует максимальной скорости реакции V_max, которая является постоянной для данной концентрации фермента.

Важной кенетической характеристикой эффективности фермента является константа Михаэлиса – К_m, которая численно равна концентрации субстрата обеспечивающей половину максимальной скорости реакции. Чем меньше К_m, тем большее сродство фермента к субстрату, то есть выше начальная скорость реакции. Чем больше К_m, тем меньше сродство фермента к субстрату, то есть меньше начальная скорость реакции. Начало распада глюкозы в печени идет при действии глюкокиназы (К_m10 ммоль/л), а в мышцах работает гексокиназа с относительной специфичностью действия с K_m0,1ммоль/л. Это имеет значение для накопления глюкозы в пищеварительный период в печени, которая используется для синтеза гликогена, в мышцах же для получения энергии уже используется минимальные количество энергии для мышечной работы.

Лабораторная работа

1. Открытие амилазы в слюне.

а) Приготовление разбавленной слюны.

Рот ополаскивают несколько раз водой для удаления остатков пищи. Отмеряют цилиндром 50 мл дистиллированной воды и ополаскивают ею рот в течении 3-5 минут в несколько приемов. Собранную жидкость (50-60 мл) фильтруют через вату и фильтрат используют для работы.

б) Гидролиз крахмала под действием амилазы слюны.

В 2 пробирки наливают по 5 мл раствора крахмала. В первую добавляют 1 мл воды, во вторую – 1 мл раствора слюны. Обе пробирки со стеклянными палочками, погруженными в них, одновременно помещают в термостат при температуре 40^оС. Через 1 минуту от каждой смеси отбирают с помощью стеклянной палочки по капле жидкости и смешивают их в отдельности с каплей йода заранее нанесенной на белую пластинку. Повторяют взятие проб через каждую минуту, пока окраска с йодом из пробирки, содержащей слюну, меняется от синей к фиолетовой, красной и, наконец, жёлтой. Ферменты амилазного комплекса ускоряют гидролиз крахмала с образованием разнообразных промежуточных и конечных продуктов:

Амилаза, присутствующая в крахмале, дает синее окрашивание с йодом, амилодекстрины (молекулярная масса 10000 – фиолетовое; эритродекстрины (М= 4000-6000); мальтоза и глюкоза совершенно не окрашиваются йодом.

К содержимому пробирок добавляют 1-2 мл фелинговой жидкости и смесь нагревают до начала кипения.

Для получения фелинговой жидкости в равных объемах смешиваются растворы Фелинга А(4% раствор медного купароса) и Фелинга Б (смесь 20% раствора К, Na винокислого + 12% NaOH) . При смешении ,образующийся гидроксид меди реагируя с сегнетовой солью дает комплекс ярко-синего цвета – фелингову жидкость. При нагревании с альдегидами (глюкозой, мальтозой, лактозой) идет окисление альдегидной группой соответствующей альдоновой кислоты и в восстановлением оксидом меди ().

Образуется красный осадок оксида меди (I) за счет восстановления гидроксида меди (II) образовавшимися мальтозой и низкомолекулярными декстринами. Контрольная проба в тех же условиях не восстанавливает гидроксид меди (II) в оксид меди (I).

2. Сравнение действия неорганических катализаторов и ферментов.

В три пробирки наливают по 5 мл 1% раствора крахмала. В первую пробирку добавляют 1 мл дистиллированной воды, во вторую – 1 мл 10% соляной кислоты, в третью – 1 мл слюны. Пробирки 1 и 3 после перемешивания помещают в термостат при 40^оС, а пробирку 2 – в в кипящую водяную баню. Через каждые 2 минуты стеклянной палочкой наносят по капле раствора из каждой пробирки на фарфоровую пластинку рядом с ранее нанесенной каплей раствора йода в йодиде калия, после чего капли соединяют и перемешивают. По интенсивности окраски пробы делают заключение о степени гидролиза крахмала.

№ пробирки	субстрат	катализатор	окраска с йодом
1	крахмал	--------
2	крахмал	НСl
3	крахмал	амилаза

Сделайте вывод.

3. Специфичность действия амилазы.

Нумеруют 4 пробирки. В пробирку 1 и 2 наливают по 2 мл раствора крахмала, в 3 и 4 – по 2 мл раствора сахарозы. Затем в 1 и 3 пробирку добавляют амилазу, в пробирки 2 и 4 – по 0,5 мл 1% раствора препарата дрожжевой сахаразы. Перемешивают содержимое и ставят на 10 минут в термостат. После охлаждения проделывают реакции с йодом на присутствие крахмала в пробирках 1 и 2, и глюкозы в пробирках 3 и 4 (фелинговой жидкостью) Сделайте заключение о специфичности изученных ферментов.

4. Термолабильность ферментов.

В 4 пронумерованные пробирки наливают по 0,5 мл разбавленной в 10 раз слюны. Пробирку 1 помещают в кипящую водяную баню, 2 – в термостат, 3 – оставляют при комнатной температуре, 4- в лед. Через 10 минут, когда содержимое пробирок примет заданную температуру, во все пробирки добавляют по 2 мл 1% раствора крахмала и оставляют при тех же условиях. Наблюдение за ходом гидролиза крахмала ведут по реакции с йодом. Берут пробы через 1, 2, 3, 4 и т.д. минут. По изменению окраски крахмала с йодом судят о степени гидролиза крахмала в каждой пробирке. Результаты наблюдений заносят в таблицу, помечая буксой «С» (синяя окраска) положительную пробу с йодом на крахмал, буквой «К» - положительную пробу на декстрины (окраска красных тонов) и буквой «Ж» - отрицательную пробу (желтая окраска йода).

№ пробирки	t в пробирке (в оС)	Реакция с йодом по истечении времени
		1	2	4	6	8	10
1	0
2	25
3	40
4	100

Делают вывод о температурном оптимуме.

5. Влияние рН на действие амилазы.

Серии растворов с определенными значениями рН получают , используя фосфатный буфер. Две бюретки заполняют 1/15 М раствором гидрофосфата натрия и 1/15 М раствором гидрофосфата калия. Растворы смешивают таким образом, что в каждой пробирке получают по 5 мл буферной смеси с определенным рН.

Na2HPO4	KH2PO4	рН
0	5	4,49
0,5	4,5	5,91
2	3	6,64
4,5	0,5	7,73
5	0	9,18

В каждую из пробирок добавляют по 1 мл 0,5% раствора крахмала, 1 мл разбавленной в 10 раз слюны и тщательно перемешивают содержимое с помощью стеклянной палочки. Далее все пробирки помещают в термостат. Спустя 1 минуту из всех пробирок палочками наносят на фарфоровую пластинку по капле смеси и смешивают с каплями йода. Пробы отбирают через каждые две минуты до тех пор, пока не наблюдается различие в окраске с йодом в испытываемых пробах. На основании результатов делают вывод об оптимуме рН для действия амилазы.

6. Действие активаторов и парализаторов на амилазу слюны.

В три пробирки наливают по 1 мл раствора слюны. В 1 пробирку добавляют 1 мл воды, во вторую 1 мл раствора NaCl, в третью по 1 мл CuSO₄. Далее во все пробирки из бюретки приливают по 2 мл раствора крахмала. Содержимое пробирок перемешивают и ставят в термостат при 40^оС. Через 2 минуты проверяют ход гидролиза крахмала по реакции с йодом на взятие пробы на фарфоровой пластине. Делают вывод об активности и парализаторе амилазы.

7. Изучение аллостерических свойств α-амилазы.

Некоторые лекарственные препараты и хлориды металлов могут оказать аллостерическое влияние на активность α-амилазы. В 2 пробирки помещаем по 3 мл 0,2% раствора крахмала. В первую пробирку добавляем 2 мл раствора лекарственного препарата, а в другую – 2 мл дистиллированной воды, после чего в обе пробирки прибавляем по 1 мл раствора слюны. На белой пластинке проверяем ход гидролиза крахмала в обеих пробирках. Делаем вывод о влиянии лекарственного препарата на активность амилазы.

Контрольные вопросы к теме:

1. Перечислите черты сходства и различия ферментов и неорганических катализаторов.

2. Химическая природа ферментов. Какие факты подтверждают белковую структуру.

3. Свойства ферментов как биологических катализаторов.

4. Что понимает под специфичностью ферментов. Какие виды специфичности различают.

5. Что понимают под конкурентным и неконкурентным торможением активности. Приведите соответствующие примеры.

6. Механизм действия ферментов

7. Что представляет собой активный центр ферментов.

8. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.

9. Основы классификации ферментов. Примеры гидролаз, оксидоредуктаз, лиаз, лигаз, изомераз, трасфераз.

Занятие № 7

Сложные ферменты,

коферментные функции витаминов.

Цели изучения:

Знать: отличие простых и сложных ферментов, функции белковой и небелковой составляющей, коферментная роль витаминов.

Уметь: определить содержание витамина С в моче

Ответить: на контрольные вопросы к теме.

Содержание темы

По своей структуре ферменты могут быть простыми, если при гидролизе образуются только аминокислоты. В составе сложных ферментов помимо белковой части содержится небелковая часть. (кофакторы). Различают две группы: кофакторы (ионы металлов) и коферменты. Ионы металлов участвуют в функционировании ферментов различными способами: а) изменяют конформацию молекулы субстрата, например, в качестве субстрата АТФ выступает в виде магниевой соли; б) обеспечивают нативную конформацию активного центра ферментов, например, Mg²⁺, Mn²⁺,Zn²⁺, Co²⁺, Mo²⁺ участвуют стабилизации активного центра ферментов; в) ионы Zn²⁺, Mn²⁺, Cu²⁺ принимают участие в переносе электронов, то есть участвуют в окислительно восстановительных реакциях. Коферменты являются органическими веществами, чаще всего производными витаминов, которые находятся в активном центре и отвечают собственно за катализ. Белковая часть апофермент содержит в себе субстратную площадку и принимает участие в первичном связывании субстратов. Кофермент может связываться с апоферментом только в момент реакции. Если он связывается с апоферментом ковалентной связью, то принимает название простетическая группа. Наиболее распространенные коферменты и участие в них витаминов даны в следующей таблице, где даны части витаминов, выполняющие каталитическую функцию. В основном водорастворимые витамины входят в состав кооферментов, хотя жирорастворимые витамины участвуют в биокатализе.

Витамины – низкомолекулярные органические соединения различной химической природы и различного строения, синтезируемые главным образом растениями, частично – микроорганизмами.

Недостаток поступления витаминов с пищей, нарушение их всасывания или нарушение их использования организмом, приводят к развитию патологических состояний, называемых гиповитаминозами. Гиповитаминозы могут возникнуть так же при действии структурных аналогов витаминов (антивитамины).

В дополнение к таблице рационально будет указать распространение в природе, суточная потребность каждого витамина и возникающий патологии при гипо-, гипер- и авитаминозах.

Итак, суточная потребность витамина В₁ (тиамин, антиневритный витамин) – 1, 2 – 2,2 мг.

Природные источники: дрожжи, фасоль, горох, отруби, картофель, морковь, при недостаче отмечается атония кишечника, боли в сердце и ввиду накопления в организме пирувата (нервного яда) развития полиневритов и известного с давних пор – болезнь бери-бери.

Витамин В₂ в сутки требуется в количестве 1,7мг.

В природе распространен в составе молока, яиц, мяса, отрубей, свежих овощей. При недостаточности витамина В₂ следствиями могут быть глоссит (воспалительные процессы слизистой языка, особенно у углов рта), остановка роста.

Витамин РР (ниацин, никотинамид) – в сутки требуется 18мг. (формулу см. в выше указанной таблице). При недостаче используется аминокислота триптофан, при белковом голодании возможно развитие пилагры, характеризующейся дерматитом, деменцией, диареей (3Д). Отмечаются головные боли, психоневрозы, галлюцинации. Природные источники – рис, хлеб, картофель, мясо, печень.

Витамин В₆ (пиридоксин, антидерматитный), требуется до 2мг в сутки (формулу см. в выше указанной таблице). В природе распространён в почках, печени, картофеле, в фасоли. Клинические проявления недостаточности витамина у детей проявляется повышенной возбудимостью ЦНС, периодическими судорогами, что связанно с достаточностью образования тормозных медиаторов.

Витамин Н (биотин) – синтезируется бактериями кишечника (формулу см. в выше указанной таблице). Наиболее богаты этим витамином печень, почки, молоко, желток яйца. Он содержится почти во всех продуктах животного и растительного происхождения. Его суточная потребность не превышает 10мкг. Недостаточность витамина может проявится при дисбактериозе кишечника, например, после приема в больших количествах антибиотиков или при введении сырого яичного белка (более 20). В белке яиц содержится гликопротеин авидин, который связывает биотин и препятствует его всасыванию из кишечника. При этом развивается специфический дерматит, характеризующегося шелушением кожи, а также обильной секреции сальных желез.

Фолиевая кислота (витамин Вс или витамин В₉)

Авитаминоз фолиевой кислоты проявляется редко, так как этот витамин достаточной степени синтезируется кишечной флорой. Однако, использование сульфаниламидных и противоопухолевых препаратов, являющихся аналогами фолиевой кислоты, может нарушатся кроветворение и связанная с этим макроцитарная анемия, задержка роста, регенерации эпителия, особенно в ЖКТ. При этом нарушается синтез азотистых оснований для синтеза ДНК и РНК. Суточная потребность колеблется от 50 до 200мкг. Однако в следствии плохого всасывания рекомендуемая доза 400мкг. Значительное количество витамина В₉ содержится в дрожжах, печени, почках и других продуктах животного происхождения.

Витамин В₁₂ (кобаламин, антианемический витамин).

Он синтезируется только микроорганизмами, из кишечника в кровь всасывается белком, синтезируемым в желудке (фактор Касла). Поэтому при операциях на желудке может развиться макроцетарная (мегобластическая) анемия, так как витамин В₁₂ активно участвует в кроветворении, что сопровождается увеличением размеров эритроцитов, снижение их количества в крови, а также падения концентрации гемоглобина в крови. Специфично также расстройство деятельности нервной системы. Суточная потребность в витамине всего 1-2мкг, содержится в животных тканях (печень, почки).

Витамин В₅ (пантотеновая кислота).

Витамин В₅ содержится в печени, желтке яиц, дрожжах, зелени. Ее суточная потребность 3-5мг. Гиповитаминоз проявляется депигментацией волос, прекращением роста, аллопецией.

Витамин С (аскорбиновая кислота) – суточная потребность около 75мг (формулу см. в выше). Рекордсменом по содержанию витамина С является сухой шиповник, далее следует облепиха, черная смородина, красный сладкий болгарский перец и почти во всех овощах и фруктах. Благодаря его антиоксидантным свойствам и участия в синтезе коллагена (основного белка соединительной ткани) при гиповитаминозе С, наблюдается кровоточивость десен, геморрагии и при полном авитаминозе развитие цинги.

Витамин Р (рутин) – по биологическим свойствам и развитию гиповитаминозов сходен с витамином С, так как при его отсутствии снижается резистентность капилляров, проявляется общая слабость, быстрая утомляемость и боли в конечностях. Витами Р распространён в природе, много его содержится в лимоне, гречихе, листьях чая. Это большая группа растительных веществ, содержащая флавон.

Суточная норма точно не установлена.