Конструирование лекарств на основе известной структуры мишени (технология sbdd)

Первый этап SBDD состоит в анализе структуры мишени и выявлении места связывания низкомолеку­лярного лиганда. Оптимальным вариантом является ситуация, когда имеется структура комплекса мише­ни с известным лигандом (субстрат или конкурентный ингибитор). В этом случае можно получить комплекс в виде кристалла и методом рентгеноструктурного анализа установить его трехмерную структуру. В противном случае потребуется поиск возможного места связывания лиганда. Самый про­стой подход - это анализ полостей (углублений) в структуре белка-мишени (фермента), и самая большая из них, скорее всего, будет представлять с высокой вероятностью активный центр фермента. В рамках более точного подхода определяются ключевые аминокислотные остатки, участвующие в ферментативном катализе (например, триада сериновых протеаз), или кофакто­ры, и тогда окружающая область будет представлять со­бой активный центр. Далее с помощью специальных процедур сопоставления лиганда и поверхности мишени определяет­ся точное место связывания лиганда в активном центре.

Наиболее популярной стратегией нахождения но­вых базовых структур биологически активных соеди­нений является поиск низкомолекулярных соедине­ний в молекулярных базах данных структур (виртуальный скрининг). Этот подход основан на предположении, что соединение с требуемой активностью уже сущест­вует, но оно не было проверено на наличие этой ак­тивности. Отметим, что в настоящее время в различ­ных базах данных химических соединений собрано несколько миллионов разнообразных низкомолеку­лярных структур.

Основным методом виртуального скрининга со­единений из химических баз данных является метод молекулярного докинга, когда к макромолекуле-мишени «подстраиваются» лиганды по принципу стерической комплементарности. В настоящее время известно много программ, ряд из которых оптимизи­рован для поиска лигандов в больших базах данных. Все программы докинга генерируют набор гипотез о вероятном положении потенциальных лигандов в месте связывания в макромолекуле-мишени. Досто­верность этих гипотез оценивается с помощью раз­личных оценочных функций (виртуальная энергия связывания, величина контактирующих поверхностей, число возможных водородных связей и т.д.). На осно­вании этих оценок выбираются соединения для даль­нейших исследований.

Преимуществом методов докинга является быстро­та получения результатов и возможность проверки ог­ромного количества молекулярных структур. Основная проблема всех методов SBDD заключается в неспособности предска­зать истинную величину энергии связывания и, соот­ветственно, перевести ее в экспериментально опреде­ляемые параметры (константа диссоциации комплекса мишень/лиганд, концентрация ингибитора, блоки­рующая 50% активности фермента, константа ингибирования фермента).

Конструирование лекарств на основе структур лигандов (технология lbdd)

Методы LBDD применяются в тех случаях, когда неизвестна пространственная структура мишени. Эти методы основаны на анализе наборов известных ли­гандов с требуемой биологической активностью. По­скольку структура места связывания лиганда в мише­ни неизвестна, первоначально необходимо построить его модель. Существует два типа моделей: фармакофорные модели и различные модели «псевдоре­цептора». Фармакофорная модель представ­ляет собой набор точек в пространстве с определен­ными физико-химическими свойствами, места связы­вания и расстояниями между ними. Модели «псевдо­рецептора» описывают в основном геометрические формы и размер места связывания в мишени. Указан­ные модели позволяют провести поиск новых лиган­дов в молекулярных базах данных. Виртуальный скри­нинг с использованием фармакофорной модели пред­полагает отбор молекул, удовлетворяющих требовани­ям данной модели относительно функциональных групп и расстояний между ними. Модели «псевдоре­цептора» позволяют искать новые лиганды методом молекулярного докинга. Метод «псевдорецептора» предпочтителен в том случае, когда фармакофорная модель содержит относительно мало фармакофорных точек, что приводит к отбору слишком большого ко­личества соединений для экспериментального тести­рования.

Существует три основных метода виртуального скрининга потенциальных лиган­дов:

1) поиск лигандов на основе сходства двухмерных структурных формул;

2) поиск в молекулярных базах данных по фармакофорным моделям;

3) поиск в базах данных методом молекулярного докинга.

Обычно до начала проведения виртуального скри­нинга выполняется ряд подготовительных процедур - препроцессинг базы данных (удаление из базы соеди­нений, не отвечающих некоторым параметрам: слиш­ком большая или малая молекулярная масса, отсутст­вие определенных химических групп, несоответствие диапазону физико-химических свойств, таких как гидрофобность, растворимость, проницаемость и др.). Кроме того, часто необходимо конвертировать двух­мерные химические структуры в трехмерные, рассчи­тать конформеры и т.п.

Для предсказания активности отобранных соеди­нений, а также для оптимизации структур базовых соединений используются методы QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship). Это направление возникло на стыке органической химии, математического моделирования и компьютерной химии. Дословный перевод: количественное соотношение структура-свойство. В русском языке для него нет аббревиатуры, поэтому используют английское сокращение.

Исторически всё началось с желания учёных найти количественную связь между структурой вещества и его биоактивностью и выразить её в виде математического уравнения. Это уравнение должно отражать зависимость одного набора цифр (свойств) от другого набора цифр (структур). Однако при этом возникает трудность. Выразить цифрой свойство достаточно просто - физиологическую активность серии веществ можно измерять количественно. Но как выразить числом структуру химического соединения? Над этим вопросом химики и математики работали в течение многих лет. В настоящее время в QSAR используются так называемые дескрипторы химической структуры.

Дескриптор - это число (или математический параметр), которое характеризует структуру органического соединения, причём так, что подмечаются какие-то важные черты этой структуры. В принципе любое число, которое можно рассчитать из структурной формулы - молекулярный вес, число определённых атомов, связей или групп, молекулярный объём, частичные заряды на атомах, - может выступать в качестве дескриптора. Например, годится ли в качестве дескриптора (то есть, характеризует ли соединение) число атомов углерода в нём? Да, и иногда это хороший дескриптор. А число нитрогрупп? Конечно: чем их больше, тем лучше взорвётся - это дескриптор для взрывчатых веществ.

Для предсказания физиологической активности в QSAR обычно используют следующие дескрипторы: электронные эффекты (влияют на ионизацию или полярность соединения), стерические и геометрические особенности структуры (играют важную роль при оценке прочности связывания исследуемого соединения с биомишенью), липофильность (способность растворяться в жирах характеризует способность лекарства преодолевать клеточные мембраны). Большую роль в QSAR имеют так называемые топологические дескрипторы.

В этом методе структурная формула - чисто математическое понятие, граф. Из теории графов можно посчитать так называемые инварианты графов, которые и рассматриваются как дескрипторы. Применяются и сложные фрагментные дескрипторы, которые оценивают вклад различных частей молекулы в общее свойство. Они значительно облегчают исследователям обратное структурное конструирование неизвестных соединений с потенциально высокой активностью. Модель QSAR - это математическое уравнение, с помощью которого можно описать физиологическую активность (и вообще любое свойство).

Метод QSAR работает следующим образом. Сначала группу соединений с известной структурой и известными значениями физиологической активности (полученными из эксперимента) делят на две части: тренировочный и тестовый набор. В этих наборах цифры, характеризующие активность, уже соотнесены с конкретной структурой. Далее выбираются дескрипторы - хорошие компьютерные программы способны перебирать многие сотни дескрипторов. На следующем этапе строят математическую зависимость активности от выбранных дескрипторов для соединений из тренировочного набора и получают так называемое QSAR-уравнение.

Правильность полученного QSAR-уравнения проверяют на тестовом наборе структур. Сначала вычисляют дескрипторы для каждой из тест-структур, подставляют их в QSAR-уравнение, рассчитывают значения активности и сравнивают их с уже известными экспериментальными значениями. Если для тестового набора наблюдается хорошее совпадение расчётных и экспериментальных значений, то данное QSAR-уравнение можно применить для предсказания свойств новых, ещё не синтезированных структур. С помощью этого метода, имея в арсенале совсем небольшое количество химических соединений с известной активностью, можно предсказать необходимую структуру и тем самым резко ограничить круг поисков.

В настоящее время активно приме­няются методы трехмерного QSAR (3D-QSAR), осно­ванные на описании пространственного распределе­ния свойств лигандов, например, методы сравнительного анализа молекулярных полей (Comparative Molecular Field Analysis, CoMFA) и сравнительного анализа подобия молекул (Comparative Molecular Similarity Indices Analysis, CoMSIA). Эти методы позволяют охарактеризовать области пространства вокруг молекул лигандов (стерические, электростати­ческие, гидрофобные и другие свойства), определяю­щие взаимодействие макромолекулы-мишени с лимандами из данного набора.

Рис. 6.  Пример предсказания активности структур методом QSAR (сравнение экспериментальных и предсказанных данных по ингибированию замещенными индолами захвата Са»+)

Методы QSAR широко используют химики во всём мире. Например, если взять выпуски журналов „Chemical reviews“ за последние годы, то только в заголовках статей эта аббревиатура встретится несколько раз. Сейчас издаётся несколько специальных журналов, посвященных QSAR.

Экспериментальное тестирование предсказанных соединений

Технология SBDD дает набор молекулярных струк­тур, ранжированных по неким виртуальным парамет­рам, но не может ответить на вопрос о возможном биологическом эффекте данных соединений. Поэтому любое компьютерное предсказание необходимо про­верять в реальных экспериментах по оценке биологи­ческой активности найденных или сконструированных и синтезированных соединений. На первом этапе обычно применяют различные тесты in vitro, которые позволяют быстро оценить способность потенциаль­ных лигандов взаимодействовать с макромолекулой-мишенью. Для этих целей предпочтительно использо­вать высоко-эффективные системы, основанные на прямом измерении взаимодействия лигандов с мише­нями в реальном времени с определением кинетиче­ских, равновесных и термодинамических параметров. Кроме того, могут быть использо­ваны разнообразные модели in vivo - от культур клеток до беспозвоноч­ных или «гуманизированных» мышей.