3.2. Культура корней

Значение подземных органов как лекарственного сырья общеизвест­но. Культура изолированных корней in vitro,наряду с культурами изолированных тканей и клеток является одним из удобных методов исследования физиологии и биохимии растений, т.к. в системе органов рост тканей и экспрессия вторичного метаболизма неразрывны. Корневые культуры многих растений способны к синтезу ценных продуктов. Однако корни в культуре растут очень медленно и не могут служить промышленным источником вторичных метаболитов.

Поэтому в последние годы проводится культивирование органов, клетки которых трансформированы с помощью Ti -плазмиды Agrobacterium. В результате такой трансформации их биомас­са увеличивается значительно быстрее без прекращения синтеза вторич­ных метаболитов. Проведенные исследования трансформированных корней (трансгенный корень, волосатый корень, hairy root) показали их высокие биосинтетические способности и экономическую ценность продуктов, синтезируемых в них.

Первые результаты были получены с волосатыми корнями белены, дурмана, белладонны, скополии, синтезирующих тропановые алкало­иды и сохраняющих эту способность в трансформированных корнях. Позднее аналогичные результаты были получены с волосатыми кор­нями Beta vulgaris и Nicotiana tabacum. Эти культуры синтезирова­ли характерные для растений продукты, причем в тех же количествах, что и корни растений.

Для получения антилейкемических алкалои­дов из Catharanthus roseus так же более предпочтительной является трансформированная корне­вая культура. Она более стабильна по продуктивности и физиологи­ческим показателям и в большей степени, чем культура побегов, спо­собна к синтезу продуктов, характерных для корней родительского растения. Такая культура на 32 день выращивания содержала около 20 алкалоидов, главным из которых был аймалицин (200 мкг на I г сырой массы).

Волосатые корни способны к быстрому наращиванию биомассы. Так, Datura stramonium за 21 день культивирования увеличила массу во­лосатых корней в 55 раз. Значительной продуктивности достигла культура волосатых корней Datura stramonium и по содержанию скополамина - 0,556 от сухой биомассы.

Получены зеленеющие культуры трансформированных корней (Bidens sulphurens), что увеличивает возможности синтеза вторичных мета­болитов, т.к. образование многих веществ (хинолизидиновые, гармаловые алкалоиды, некоторые фенольные соединения и др.) связано с хлоропластами.

Таким: образом, культура органов - это еще одна перспективная биотехнологическая модель культивирования растений для получения ценных продуктов их биосинтеза. Однако для того, чтобы стать про­мышленным источником, необходимо:

а) разработать биотехнологические установки для крупно-масштабного выращивания органных культур;

б) получить штаммы с высоким содержанием целевого продукта;

в) совершенствовать способы выделения и очистки целевого продукта.

4. Клональное микроразмножение растений

Клональное микроразмножение (микроклональное размножение) - это массовое бесполое размноже­ние растений в культуре тканей и клеток, при котором, возникшие фор­мы растений генетически идентичны исходному экземпляру. В основе метода лежит использование уникальной способности растительной клетки реализовать присущую ей тотипотентность (способность реализовать генетическую информацию ядра клетки) и дать начало целому растительному организму. Этот метод позволяет за короткий срок получать ог­ромное количество однородного в генетическом плане посадочного ма­териала растений, причем свободного от патогенных микроорганизмов и во многих случаях от вирусов. Применение клонального микроразмно­жения ускоряет селекцию новых сортов растений до 2-3 лет вместо 10-12 лет. Существует несколько основных разновидностей метода:

I) Образование придаточных (адвентивных) побегов непосредст­венно из тканей эксплантанта основано на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях восстанавливать недо­стающие органы и регенерировать целое растение. На среде Мурасиге-Скуга, содержащей 2,68 мкМ нафтилуксусной кислоты НУК и 2,31 мкМ кинетина, на поперечных срезах черешков листьев фиалки за 6-8 недель формируется множество придаточных побегов, дающих начало целым растениям.

2) Индукция развития пазушных меристем основана на активиза­ции роста заложенных в пазухах листьев растений почек и получении из них побегов и затем целых растений. Достигается это путем снятия апикального доминирования или удалением главного побега и микроче­ренкованием в пробирке или введением в питательную среду цитокининов, индуцирующих развитие пазушных побегов. Во всех случаях раз­вившиеся побеги отделяют друг от друга и повторно культивируют на питательной среде, в свою очередь стимулирующей пролиферацию пазуш­ных меристем и возникновение побегов. Так верхушку побега герберы помещают на среду Мурасиге-Скуга, содержащую 4,62 мкМ кинетина. Ве­гетативный побег, несущий у своего основания листья, формируется че­рез 5-6 недель. В основании побега на агаризованной среде развивает­ся каллус и дифференцируются корни, в пазухах листьев закладываются почки. Введение этих почек в среду с кинетином приводит к развитию побегов. Они растут, в пазухах их листьев, в свою очередь, наблюдает­ся активизация пазушных почек, каждая из которых может дать побег.

3) Пролиферация каллуса и последующая регенерация из него растений (морфогенез) наблюдается на питательных средах с определенной концентрацией и соотношением в них фитогормонов цитокинины/ауксины. Так пролиферация каллуса побегов герберы происходит на среде с 4,62 мкМ кинетина и 5,37 мкМ (НУК). При этом из каллусной ткани могут образоваться одновременно почки, побеги и корни. Только корни обра­зуются из каллуса на среде с 5,4 мкМ НУК или 0,9 мкМ 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2-4-Д). Привык­шие каллусные клетки, т.е. полученные в результате многих пересе­вов, иногда сами начинают синтезировать фитогормоны. Регенерацию растений лучше осуществлять из первичного каллуса, так как при мно­гочисленных пересевах изменяется плоидность каллусных клеток и т.п., растения из таких клеток получаются с пониженной жизнеспособностью, низкорослые, с неправильным жилкованием листьев, уродствами.

4) Соматический эмбриогенез характеризуется тем, что зародышеподобные структуры (эмбриоиды) развиваются из соматических клеток культивируемых тканей эксплантанта (каллуса) при уменьшении кон­центрации или полном исключении из среды ауксинов.

На этапе высадки растений "из пробирки" в почву проводят за­калку растений - снижают температуру выращивания до 20-25⁰С, увели­чивают интенсивность освещения до 5-10 тысяч люкс в течение 14-16 часов в сутки, повышают влажность воздуха до 70-75%, создавая в итоге даже атмосферу тумана.

Л Е К Ц И Я №9