Регулируемые промоторы

Наиболее широко для создания экспрессирующих векторов используются следующие сильные регулируемые промоторы: промоторы lac- и trp-оперонов Е. coli; специально сконстру­ированный tac-промотор, состоящий из отдельных фрагментов lac- и trp-оперонов и ряд других. С каждым из них связываются соответствующие репрессоры, ко­торые опосредуют включение и выключение транскрипции специфических генов.

В отсутствии лактозы в среде lac- промотор Е. coli находится в репрессированном состоянии и транскрипция его гена блокирована. Индукция, или включение lac- оперона происходит при добавлении в среду лактозы. Аналогично, активность trp-оперна регулируется добавлением триптофана.

Другим способом регулирования экспрессии является использование термочувствительных промоторов, например промотор бактериофага рL. Белок- репрессор, блокирующий данный промотор, активен при 31⁰С, но неактивен при 38⁰С, следовательно, при инкубировании бактерий при 31⁰С клонированный ген не экспрессируется и, наоборот повышение температуры вызывает инактивацию репрессора и высокий уровень синтеза нужного белка. Это очень удобно, т.к. позволяет управлять процессом культивирования продуцента, проводя его наработку при 31⁰С и вызывая синтез целевого продукта только при достижении оптимального состояния культуры (стадия роста, плотность), путем повышения температуры до 38⁰С.

Наличие регулируемых промоторов позволяет предотвращать преждевременный, бесконтрольный синтез неконститутивных рекомбинантных белков, который будет тормозить рост клеточной культуры в lag- и log-фазах и запускать его только после накопления необходимого, оптимального количества биомассы клеток (в стационарной фазе).

Суммарная активность экспрессируемого гена возрастает с ро­стом числа копий рекомбинантной ДНК в расчете на клетку. Ис­пользуя многокопийные плазмиды, можно обеспечить сверхсинтез нужных белковых продуктов. Поэтому получение бактериаль­ных штаммов-сверхпродуцентов - одна из важ­нейших задач современной биотехнологии в экономическом, ме­дицинском и социальном аспектах. Обычно используемые сейчас плазмидные векторы поддержива­ются в клетке в количестве 20-50 копий и это не предел. Так в лабораторных условиях получены температурно-чувствительные мутантные плазмиды, способные накопить до 1- 2 тыс. ко­пий на клетку без нарушения жизненно важных функций бакте­рий. Естественно, подбор условий культивирования для таких продуцентов играет решающее значение.

Интеграция чужеродной днк в хромосому хозяина

Наряду с достоинствами использование рекомбинантных плазмиид имеет целый ряд существенных недостатков, связанных с возможностью их утраты клетками в процессе длительного культивирования.

Это обусловлено тем, что при наличии в клетке чужеродной химерной плазмиды часть энергети­ческих и материальных (аминокислоты, нуклеотиды) ресурсов расходуется на ее репликацию, транскрипцию и синтез чужеродных белков, которые она ко­дирует. Чем больше количество таких плазмид в клетке, тем больше клеточных ресурсов уходит на обеспечение процессов не нужных для ее нормальной жизнедеятельности. Поэтому в процессе роста популяции, клетки содержащие меньшее количество плазмид или потерявшие их совсем растут и размножаются бы­стрее тех, в которых они сохранились на прежнем уровне, и, в конеч­ном счете, оказываются в культуре преобладаю­щими.

В результате по прошествии нескольких генераций количество синтезируемого продукта клонированного гена может значительно уменьшится или он вообще перестанет вырабатываться. Разработано, по крайней мере, два подхода к решению этой про­блемы. В лабораторных условиях для сохране­ния рекомбинантных плазмид клетки выращивают в присутствии антибиотиков или метаболитов, обеспечиваю­щих рост только тех клеток, в которых есть такие плазмиды. Однако добавление антибиотиков и каких-то других веществ в культуры, выращиваемые в больших объемах, или в промышленные фер­ментеры приводит к значительному удорожа­нию конечного продукта.

Особенно важно, что­бы клонированные гены сохранялись, не передаваясь другим микроор­ганизмам за счет коньюгации плазмид, в том случае, когда сконструирован­ный микроорганизм предназначен для исполь­зования вне стен лаборатории. Он должен не только оставаться эффективным, но и быть эко­логически безопасным.

Методом, позволяюшим избежать утраты или нежелательной коньюгации клонируемого гена является включение клониро­ванной ДНК непосредственно в хромосомную ДНК хозяйского организма.

При встраивании нужного гена в хромосом­ную ДНК хозяина нужно позаботиться о том, чтобы сайт интеграции не находился внутри ге­на, кодирующего важную клеточную функцию. Для этого чужеродный ген включают в заведомо несущественный участок. Кроме того, для обеспе­чения эффективной экспрессии его помещают под контроль регулируемого промотора. Для ин­теграции в нужный сайт вводимый ген должен содержать нуклеотидную последовательность длиной не менее 50 нуклеотидов, сходную с та­ковой в хромосомной ДНК, в пределах которых и должен произойти физический обмен (реком­бинация) между двумя молекулами ДНК.