Основы генетической инженерии.

В первой половине 70-х годов ХХ в. развитие молекулярной биологии привело к возникновению новой экспериментальной технологии, которая получила в СССР название “генная инженерия”, а в западной литературе именуется “работой с рекомбинантными молекулами ДНК”.

Молекула рекомбинантной ДНК представляет собой два компонента, соединенные в бесклеточной системе: вектор, обеспечивающий механизм репликации и экспрессии, и фрагмент клонируемой («чу­жеродной») ДНК, содержащий интересующие исследователя гене­тические элементы, которые нужно перенести в реципиентную клетку (клетка-хозяин). Генетическая инженерия возникла на стыке многих биологических дисциплин: молекулярной генетики, энзимологии, биохимии нуклеиновых кислот и др. Первая рекомбинантная ДНК получена в 1972 г. (П.Бергом с сотр.) и была со­ставлена из фрагмента ДНК обезьяньего вируса ОВ40 и бакте­риофага λ dvgal с галактозным опероном Е. coli. Формально 1972 г. следует считать датой рождения генетической инженерии.

1.Технология конструирования и работы с рекомбинантными днк

Сущность генетической инженерии сводится к целенаправ­ленному конструированию искусственных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата реципиентного организма и, кроме того, они привно­сят в него новые генетические и физиолого-биохимические свой­ства, полезные для человека. К числу таких свойств можно отне­сти синтез аминокислот и белков, гормонов, ферментов, вита­минов и др. Источником генетического материала могут выступать различные организмы не способные в обычных, природных условия, к обмену генетической информацией с организмами - реципиентами.

В настоящее время не существует единого, универсального набора методик, но чаще всего эксперименты с рекомбинантной ДНК проводят по следующей схеме.

1.Из организма - донора нужных генов - экс­трагируют нативную ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чу­жеродная ДНК), подвергают ее избирательному фермента­тивному гидролизу по определенным участкам (расщепляют, разрезают) с помощью соответствующих рестриктаз и соединяют (лигируют, сшивают) с другой ДНК (вектор для клонирования, клонирую­щий вектор) с образованием новой, рекомбинантной молекулы (конструкция «клонирую­щий вектор - встроенная ДНК»).

2. Эту конструкцию вводят в клетку-хозяина (реципиент), где она реплицируется и пере­дается потомкам. Этот процесс называется трансформацией.

3.Идентифицируют и отбирают клетки, несу­щие рекомбинантную ДНК (трансформиро­ванные клетки).

4.Получают специфический белковый про­дукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена.

Рассмотрим эти процессы поподробнее.

Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей осуществляется особыми бактериальными внутриклеточными ферментами - рестрикцирующими нуклеазами, способными разрушить чужерод­ную ДНК.

Каждый фермент, способный разрушить чужеродную ДНК, опознает в ней специфическую последовательность из 4-6 нуклеотидов. Соответствующие последовательности в геноме продуцирующих их бакте­рий замаскированы метилированием остатков дезоксирибозы с помощью ферментов-метилаз.

Согласно номенклатуре, предло­женной X. Смитом и Д. Натансоном, название рестриктазы складывается из трех букв: первая обозначает ро­довое название, две последующие - первые буквы вида.

Например, фер­мент из Е. coli обозначают как Есо или из Haemophilus influenzae - Hin и т.д. Типовая или штаммовая идентификация следует за родовидовой, например, EcoRI или Hindll и т. д. В настоящее время различные фирмы вы пускают более 100 разнообразных ферментов, опознающих различные последовательности нуклеотидов. Для каждого конкретного фермента они различаются по длине, первичной структуре и способу разрыва молекулы ДНК. Подавляющее большинство ферментов разрывает только двунитевую ДНК с образованием серии фрагментов, называемых рестрикционными (или рестриктами) с тупыми либо липкими концами).

Если рестриктазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов то на концах фрагментов образуются короткие одноцепочечные участки, способные образовывать комплементарные пары оснований с любым другим одноцепочечным участком, полученным с помощью того же фермента (“лип­кие концы”). Если разрыв происходит без смещения, то образуются фрагменты ДНК c “тупыми концами”.

Один из важнейших этапов конструирования молекулы рекомбинантной ДНК является лигирование (или сшивание) генов с помощью фермента ДНК-лигазы. Сшивание фрагментов ДНК, содержащих нужные гены, может проходить как по “липким”, так и по “тупым” концам. Однако эффективность сшивки по “тупым” концам ниже чем по “липким”.

-- -- АТГЦААТТ ЦАГТЦ-- -- -- --ГЦГГ ЦЦГТ-- --

-- -- ТАЦГ ТТААГТЦАГ-- -- -- --ЦГЦЦ ГГЦА-- --

сшивание ДНК-лигаза сшивание ДНК-лигаза

-- -- АТГЦААТТ—ЦАГТЦ-- - -- --ГЦГГ—ЦЦГТ-- --

-- --ТАЦГ—ТТААГТЦАГ-- -- -- --ЦГЦЦ—ГГЦА-- --

сшивание по “липким” концам сшивание по “тупым” концам

При отсутствии комплиментарных “липких” концов у сшиваемых фрагментов их достраивают, т.е. синтезируют искусственно ферментативным путем. Для этой цели применяют так называемые линкеры (или переходники) – короткие участки ДНК, имеющие разные “липкие” концы, комплиментарные сшиваемым фрагментам.

-- --АТГЦААТТ ТАЦГ-- --

-- --ТАЦГ АГГТАТГЦ-- --

Х

“Липкие” концы не комплиментарны. Сшивки нет.

-- --АТГЦААТТ ЦТГАГАТЦЦА ТАЦГ -- --

- - -- ТАЦГ ТТААГАЦТЦТ АГГТАТГЦ-- --

фрагмент 1 линкер фрагмент 2

-- --АТГЦААТТ-- --ЦТГАГАТЦЦА-- --ТАГЦ-- --

-- --ТАЦГ-- --ТТААГАЦТЦТ-- --АГГТАТГЦ-- --

сшивание с помощью линкера

Линкерные фрагменты не только обеспечивают объединение генов, но и обусловливают их экспрессию, в связи с чем часто в середину линкера помещают какой либо регуляторный генетический элемент, например промотор, или участок связывания с рибосомой.

После того как рекомбинантная ДНК сшита, ее можно ввести в жи­вые клетки. Но поскольку она не способна к самовоспроизведе­нию, ее быстро разрушат внутриклеточные нуклеазы. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического ап­парата клетки, она должна либо встроиться (интегрироваться) в ее геном (в хромосому) и реплицироваться за его счет, либо быть способной к автономной репликации. Принято молекулы ДНК, способные ак­цептировать чужеродную ДНК и автономно реплицироваться, называть векторными молекулами. К числу векторов относят плазмиды, бактериофаги, вирусы животных. Векторы должны обла­дать следующими особенностями:

1. Иметь субстратные участки для определенных эндонуклеаз рестрикции, в которые после их разрезания можно встроить нужный ген.

2. Иметь свойства репликона, т.е самовоспроизводиться.

3. Содержать один или несколько маркерных генов, которые после проникно-вения вектора в клетку придают ей фенотип, сви­детельствующий о присутствии вектора.

В частности, для бактериальных векторов в качестве маркерных генов чаще всего используются гены, вызывающие устойчивость клеток к некоторым антибиотикам.

4. Иметь малый размер и способность проникать через клеточную оболочку

Таким образом, все векторы обеспечивают репликацию встроен­ных генов, их экспрессию, интеграцию в хромосому клетки и т.д.

Чаще других в генетической инженерии в качестве векторов исполь­зуют плазмиды. Плазмидами называют специфические бактериальные репликоны (внехромосомные элементы наследственности), способные к длительному автономному существованию и стабильно насле­дуемые. Они представляют собой двуцепочечные кольцевые моле­кулы ДНК с вариабельными молекулярными массами. По разме­ру они соответствуют 1 - 3 % от хромосомы бактериальной клетки. Так, молекулярная масса одной из самых мелких плазмид, найденных у Е. coli, составляет 1,5 МДа, а клетки псевдомонад содержат плаз­миды с Мг около 300 МДа, что составляет 15 % от Mв хромосом этих бактерий. Плазмиды разделяют на конъюгативные, способ­ные сами перенестись в реципиентные клетки с помощью конъю­гации, и неконъюгативные, не обладающие этим свойством. Они детерминируют разные свойства: резистентность к антибиотикам (R-плазмиды); биодеградацию (D-плазмиды) и др. Например, плаз­миды стафилококков несут гены устойчивости к пенициллину, соединениям ртути и др. Гены устойчивости к тяжелым металлам обнаружены также в составе R-плазмид Е. coli. Плазмиды могут управлять синтезом инсектицида в клетках Bacillus thuringiensis. F-плазмида Е. coli или FP-плазмиды псевдомонад являются поло­выми факторами. Плазмида pSIOl с Мг 5,8 МДа несет ген устой­чивости к тетрациклину (селективный маркер). У различных мик­роорганизмов - Е. coli, Salmonella, Bacillus, Saccharomyces обнаружены Col-плазмиды, обеспечивающие синтез разных колицинов - высокоспецифических антибиотиков, подавляющих жизнедеятельность других штаммов микроорганизмов того же вида или родственных видов. Количество плазмид в клетке может коле­баться от одной до более ста. В целом, чем крупнее плазмида, тем меньше количество ее копий в клетке.

Первый плазмидный вектор был получен С.Коэном (1973). Его источником была плазмида Е. coli R_6-5 с Mr 65 кДа. Плазмида стала родоначальником серии векторов и других структур.

Особое место в генетическом манипулировании занимает плазмида (ColE1), от­носящаяся к группе колициногенных плазмид Е.coli. ColE1 реп­лицируется независимо от хромосомы и присутствует в количе­стве примерно 24 копий на клетку. Ее широко используют благо­даря селективному маркеру (способность к синтезу антибиотика колицина) в качестве вектора для клонирования фрагментов про- и эукариотической ДНК в Е. coli.

Плазмида pBR313 содержит уникальные участки расщеплений нескольких рестриктаз: EcoRI, Hindlll, BamHI, Sail, Xmal и Hpal. Конструируя рекомбинантную ДНК, в эти участки можно встраивать фрагменты чужеродной ДНК, полученные с помощью соответствующих рестриктаз.

На рис. изображена схема распо­ложения генов в плазмиде pBR322.

Плазмида pBR322 содержит два гена, программирующих устойчивость к двум различным ан­тибиотикам - тетрациклину (ген tet) и ампициллину (ген blа). В гене tet находятся уникальные участки расщепления рестриктазами HindIII, BamHI и SalI, а в гене blа - участок расщепления PstI. Если разрезать плазмиду любой из рестриктаз, участок расщепле­ния которой находится в гене tet, и соединить ее методом «лип­ких» концов с чужеродным фрагментом ДНК, то в полученной рекомбинантной молекуле останется нетронутым только ген blа, а ген tet утрачивает свою активность, так как его целостность на­рушается вставкой. Напротив, при разрезании плазмиды рестриктазой PstI и внедрении в этот участок фрагмента ДНК инактивируется ген blа, тогда как ген tet продолжает кодировать белок, обеспечивающий устойчивость Е. coli к тетрациклину. Плазмидные векторы в настоящее время чрезвычайно разнообразны за счет следующих свойств:

1.Наличие большого количества участков рестрикции, отвечающих различным рестриктазам.

2.Возможность уменьшения размеров плазмиды вследствие изъятия участков, не обязательных для репликации и замены их клонируемыми генами.

3.Гибридизации векторов одного рода с другими векторами или природными плазмидами (например, получены гибридные векторы комбинацией плазмиды и фага λ (при этом вновь сконструиро­ванная рекомбинантная ДНК должна сохранить репликационные свойства исходной плазмиды);

4.Наличие селективных генетических маркеров, позволяющи­х вести отбор рекомбинантных клонов.

Эукариотические вирусы до сих пор нашли более скромное при­менение в качестве векторов. Практически используются только онкогенный вирус SV 40 и его производные. Все эти векторы - дефектные вирусы, не способные давать полноценные вирусные частицы в клетке хозяина. Клонируемую ДНК можно вводить и в другие репликоны, способные размножаться в клетках, напри­мер бактериофаги. Чаще всего из известных фагов в качестве век­торов применяют сконструированные производные фага λ и фа­гов М13 и fd. В векторах на основе бактериофага λ используется его особенность, состоящая в том, что большая часть его ДНК не участвует в размножении фага в клетке и может быть удалена . Это позволяет вводить вместо нее чужеродную, клонируемую ДНК в ДНК фага λ и использовать его в качестве вектора.

Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чу­жеродными генами часто называют гибридными (или химерными) плазмидами (или фагами). После конструирования рекомбинант­ных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм: бактериальную, грибную, растительную или животную клетку. Трансформация предусматривает предвари-тельную обра­ботку клеток соединениями, обусловливающими проникновение ДНК внутрь клеток (раствор СаС1₂) за счет увеличения проницаемости клеточной стенки, с последующим их помещением в селективирующую среду, в которой способны существовать только клетки, получившие век­торную молекулу, например в среду с определенным антибио­тиком. Другим способом увеличения проницаемости клеточной стенки является электропорация, когда клеточную суспензию обрабатывают короткими импульсами переменного тока высокого напряжения (порядка 2500 вольт). После такой обработки эффективность трансформации повышается, в зависимости от размеров плазмид, в 10⁶ – 10⁹ раз.

Процесс инфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, назван трансфекцией.

Однако эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низка. Поэто­му среди бактерий, подвергшихся трансформации, только неболь­шая часть оказывается трансформированной (обычно одна из тысячи). Кроме того, часть этих бактерий может содержать исходную, не трансформированную плазмиду. Отделение клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, от об­щей массы осуществляется в процессе клонирования. Для клони­рования трансформиро-ванную бактериальную суспензию низкой концентрации выливают на твердую питательную среду, например на агар или чаще на нитроцеллюлозные фильтры, помещенные на чаш­ку Петри с питательной средой, из расчета 5 - 10 бакте­рий на 1 см² поверхности. Бактериальная клетка на поверхности фильтра начинает делиться с образованием в итоге маленькой коло­нии, похожей на шляпку гриба. Эта колония называется клоном, причем из каждой клетки образуется свой клон, все клетки кото­рого имеют свойства бактерии-родоначальника.

Отбор бактерий-трансформантов можно продемонстрировать, используя рассмотренную ранее плазмиду pBR322, содержащую два гена устойчивости к тетрациклину и ампициллину. Для отбора этих бак­терий в питательную среду добавляют антибиотик - или ампициллин, или тет­рациклин в зависимости от того, какой из генов (blа или tet) ос­тался интактным (неповрежденным) после введения чужеродной ДНК. На такой сре­де клоны образуют клетки только с плазмидами (рекомбинантными и нерекомбинантными), а все остальные погибают. Для отделения рекомбинантных бактерий от исходных используют следующую технологию. К фильтру с исходными колониями прижимают свежий нитроцеллюлозный фильтр (фильтр-реплика), который затем переносят на чашку Петри с аналогичной питательной средой, но, содержащей антибиотик, ген ус­тойчивости к которому был разрушен при создании рекомбинантов. На этих фильтрах дают клоны только те бактерии, кото­рые содержат исходную плазмиду, а рекомбинантные бактерии их не образуют. Анализируя расположение клонов на исходном фильтре, и фильтре-реплике, выделяют колонии, содержащие трансформированные клетки.

При поиске рекомбинантных клонов успешно применяют метод радиоавтографии, основанный на способности двух любых одноцепочечных комплиментарных фрагментов ДНК спариваться (гибридизоваться) между собой. Если один фрагмент (ДНК-зонд, гибридизационный зонд) содержит радиоактивную метку (обычно изотоп фосфора 32 или иода 125), то радиоактивной будет и гибридизованная молекула ДНК или ее фрагмент.

Технология подготовительного этапа радиоавтографического скрининга имеет много общего с описанной выше процедурой, используемой при клонировании. Полученную с трансформированной бактериальной колонии фильтр-реплику подвергают щелочной обработке при высокой температуре. При этом клетки в колониях лизируются, а клеточная ДНК денатурируется с разрушением двойной спирали и одиночные цепи связываются с нитроцеллюлозой в том участке, где была расположена соответствующая колония. Далее фильтр подвергают обработке раствором, содержащим специально приготовленные, меченные изотопами, одноцепочечные фрагменты клонируемой ДНК а затем промывают для удаления раствора с ДНК-зондом. На тех участках фильтра, где находились трансформированные клетки будет происходить процесс гибридизации клонируемой ДНК с ДНК-зондом и они окажутся радиоактивными.

Рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы и по синтезируемому ими продукту. Технически эта процедура имеет много общего с гибридизацией. Все кле­точные линии (клоны) высевают на чашки с питательной средой. Выросшие коло­нии переносят на фильтр, клетки лизируют, а высвободившиеся белки фиксируют на фильтре. Затем на фильтр наносят первые антитела, кото­рые специфически связываются с данным бел­ком (антигеном), все несвязавшиеся антитела удаляют, а фильтр помещают в раствор вторых антител, специфичных в отношении первых ан­тител. Во многих тест-системах используют конъюгаты вторых антител с ферментом, напри­мер с щелочной фосфатазой. После отмывания фильтра добавляют бесцветный субстрат. Если вторые антитела связываются с первыми, то под действием фермента происходит гидролиз суб­страта с образованием окрашенного вещества в том месте, где идет реакция. Те клетки на чашке, которые соответствуют окрашенным пятнам на фильтре, содержат или полноразмерный ген, или достаточно протя­женный его участок, обеспечивающий синтез белкового продукта, узнаваемого первыми анти­телами. По окончании иммунологического скрининга необходимо дополнительно определить, какой именно из отобранных кло­нов содержит полноразмерный ген.