- •«Российский государственный университет нефти и газа имени и. М. Губкина» в г. Оренбурге
- •Лекция n1
- •1.Предмет и задачи биотехнологии
- •2.Выбор биотехнологических объектов
- •Лекция №2 Метаболизм. Основные процессы клеточного метаболизма. Механизмы регуляции метаболитических процессов.
- •Регуляция синтеза белков с точки зрения молекулярной биологии.
- •Лекция № 3 Понятие о первичных и вторичных метаболитах.
- •Теоретические основы получения первичных метаболитов.
- •Анаэробные процессы.
- •Аэробные процессы
- •2.Получение глюконовой кислоты.
- •3.Получение итаконовой кислоты.
- •Процессы с полным окислением
- •1. Получение лимонной кислоты.
- •2.Получение кетокислот (пировиноградной и кетоглутаровой).
- •Лекция №4 Теоретические основы получения вторичных метаболитов
- •1. Получение антибиотиков
- •2.Производство аминокислот
- •3.Производство витаминов. (самостоятельно)
- •Производство водорастворимых витаминов (в2, в12).
- •Производство жирорастворимых витаминов (a, d).
- •Использование процесса микробной биотрансформации при промышленном получении витамина с. Лекция №5 биотрансформация и биодеградация органических соединений
- •1.Биотрансформация органических соединений
- •1.1.Процессы микробной химии
- •1.2.Методы микробной трансформации органических соединений.
- •I. Использование ферментативных свойств интактных (нормальных) клеток:
- •III. Конструирование штаммов с повышенной способностью к трансформации органических соединений.
- •IV. Использование ферментных препаратов, иммобилизованных ферментов и клеток.
- •1.2.1.Трансформация растущей культурой в периодических условиях
- •1.2.2.Трансформация суспензиями неразмножающихся клеток
- •1.2.3.Трансформация осуществляемая спорами грибов и актиномицетов
- •1.2.4.Непрерывные методы культивирования
- •1.2.5.Кометаболизм
- •1.2.6.Применение поврежденных и дезинтегрированных клеток
- •1.2.7.Ингибирование определенных участков метаболитических путей.
- •1.2.8.Применение мутантов с блокированным синтезом определенных ферментов
- •1.2.9. Конструирование штаммов с повышенной способностью к трансформации
- •1.2.10.Ферментные препараты и иммобилизованные ферменты
- •1.2.11.Иммобилизация клеток
- •1.2.12.Политрансформации
- •1.Подбор штамма, способного осуществлять нужную трансформацию
- •1.3.Микроорганизмы трансформирующие органические соединения
- •1.4.Примеры трансформации органических соединений
- •2.Биодеградация токсичных соединений
- •2.1.Деградация ксенобиотиков с помощью микроорганизмов
- •2.2. Использование методов генной инженерии для биодеградации ксенобиотиков
- •Лекция 6 Основы технологии, процессы и аппараты биотехнологических производств
- •Подготовка и стерилизация питательных сред.
- •Подготовка воздуха
- •Подготовка и наработка продуцента.
- •Основы технологии микробиологических производств
- •Поверхностное культивирование
- •Способы поверхностного культивирования
- •Выделение и очистка целевых продуктов
- •Глубинное культивирование
- •Процесс идеального (полного) вытеснения;
- •Процесс идеального (полного) смешения;
- •Лекция №7 основное оборудование биотехнологических производств.
- •Классификация ферментеров
- •Ферментеры с подводом энергии жидкой фазой (группа фж).
- •Ферментеры с подводом энергии жидкой и газовыми фазами (фжг).
- •Особенности конструирования и работы ферментационного оборудования
- •Термостатирование
- •Пеногашение
- •Проблемы масштабирования ферментационных процессов
- •Лекция № 8
- •1.Культуры клеток и тканей растений и животных
- •2.Технология культивирования клеток и тканей
- •2.1.Получение культуры каллуса, суспензионных культур и одиночных клеток.
- •2.2. Факторы, влияющие на продуктивность культур тканей
- •2.2.1. Происхождение ткани
- •2.2.2. Клеточная дифференциация in vitro.
- •2.2.3.Питательные среды для культивирования клеток и тканей.
- •2.2.4.Асептика
- •2.2.5.Физические факторы, влияющие на развитие клеточных культур.
- •2.2.6. Химические факторы, влияющие на синтез вторичных метаболитов.
- •2.2.7. Способы выделения целевого продукта.
- •3.Культуры органов растений
- •3.2. Культура корней
- •4. Клональное микроразмножение растений
- •1.Клеточная инженерия
- •1.1.Получение протопластов
- •1.2.Культивирование протопластов
- •1.3.Слияние протопластов
- •1.4.Гибридизация соматических клеток
- •2.Генетические основы совершенствования биообъектов.
- •2.1.Селекция микроорганизмов – продуцентов практически важных веществ.
- •2.2.Методы и подходы в селекции
- •Основы генетической инженерии.
- •1.Технология конструирования и работы с рекомбинантными днк
- •Лекция №11 Оптимизация экспрессии клонированных генов.
- •Экспрессия генов при участии сильных регулируемых промоторов
- •Регулируемые промоторы
- •Интеграция чужеродной днк в хромосому хозяина
- •Химерные белки
- •Расщепление химерных белков
- •Повышение эффективности секреции
- •Метаболитическая перегрузка
- •Направленный мутагенез: методика
- •Направленный мутагенез
- •Получение рекомбинантных белков с помощью эукариотических систем
- •Лекция № 12 Получение лекарственных препаратов белковой природы на основе методов генной инженерии
- •1.Получение инсулина.
- •2.Получение соматостатина
- •3.Синтез соматотропина
- •5.Иммуномодуляторы
- •6.Использование трансгенных животных и растений для получения лекарственных препаратов белковой природы
- •Лекция №13 Использование рекомбинантных микроорганизмов для получения коммерческих продуктов небелковой природы.
- •1.Синтез l-аскорбиновой кислоты
- •2.Антибиотики
- •2.1.Синтез новых антибиотиков
- •2.2.Разработка новых методов получения поликетидных антибиотиков
- •2.3.Усовершенствование производства антибиотиков
- •Лекция №14
- •1.Генная инженерия в производстве вакцин.
- •2. Генная терапия онкологических заболеваний.
- •3.Лекарственные препараты на основе олигонуклеотидов
- •3.1..«Антисмысловые» олигонуклеотиды как лекарственные средства
- •3.2. Рибозимы как лекарственные средства
- •3.3. Малые интерферирующие рнк.
- •Лекция №15
- •1.Моноклональные антитела в диагностике и лечении.
- •1.1.Использование антител в иммуноферментном анализе
- •1.2.Моноклоналъные антитела
- •1.3.Образование и отбор гибридных клеток
- •1.4.Идентификация гибридных клеточных линий, секретирующих специфические антитела
- •1.5.Моноклональные антитела как лекарственные средства
- •1.6. Лекарственные вещества, связанные с моноклоналъными антителами
- •1.7. Профилактика отторжения трансплантированных органов
- •2.Системы днк-диагностики
- •Примеры днк-диагностики Диагностика малярии
- •Диагностика Trypanosoma cruzi
- •Лекция №16
- •1.Геномика, протеомика и биоинформатика. Медицинская биотехнология в “постгеномную эру”
- •Новые подходы к разработке лекарств в постгеномную эру.
- •1. Кризис классической фармакотерапии и фарминдустрии.
- •2. От гена до прототипа лекарства. Новые подходы к разработке лекарств в постгеномную эру.
- •2.1. Поиск биомишеней для создания новых лекарственных средств на основе анализа геномных данных
- •2.1.1. Основные критерии селекции мишеней для создания антимикробных средств.
- •2.1.2. Экспериментальные технологии валидации потенциальных мишеней.
- •Методы валидации биомишеней.
- •1. Протеомные методы валидации потенциальных мишеней.
- •2. Геномные методы валидации потенциальных мишеней.
- •3. Валидация потенциальных мишеней in vivo.
- •2.1.3. Пространственная структура мишеней.
- •2.1.3.1. Экспериментальные методы расшифровки пространствен-ных структур белков
- •2.1.3.2. Моделирование пространственных структур белков.
- •2.1.4. Конечная селекция и приоритезация потенциальных мишеней
- •2.2. Основные типы биомишеней.
- •2.2.1.Генные мишени
- •2.2.2. Белковые биомишени.
- •2.2.2.1. Белковые мишени для разработки противовирусных препаратов.
- •2.2.2.2. Белковые мишени для антибактериальных и противо-опухолевых препаратов
- •2.2. Стратегия поиска соединений – лидеров.
- •2.2.1. Комбинаторная химия и высокопроизводительный скрининг
- •2.2.2.1.Технология комбинаторного синтеза
- •Жидкофазный синтез
- •1. Синтез смесей
- •2. Параллельный синтез
- •Преимущества жидкофазного синтеза:
- •Недостатки:
- •Твердофазный синтез
- •2.2.2.2. Планирование и дизайн комбинаторного синтеза
- •1.Темплейты
- •2. Дизайн молекул. Структурные критерии.
- •Критерии выбора центроидов.
- •Варьирование заместителей
- •3. Дизайн библиотек для оптимизации лидера
- •2.2.2.3.Оптимизация скрининга
- •2.3. Медицинская химия
- •2.4. Рациональный дизайн лекарств. Общая схема.
- •Конструирование лекарств на основе известной структуры мишени (технология sbdd)
- •Конструирование лекарств на основе структур лигандов (технология lbdd)
- •2.4.2. Разработка лекарств на базе соединений – лидеров.
- •2.5. Фармакогеномика и новые подходы к терапии и клиническим испытаниям лекарств.
- •2.6. Лекарство, действующее на несколько молекулярных мишеней в организме: исключительная ситуация или будущее фармакотерапии?
Методы валидации биомишеней.
Разрабатываемые в настоящее время технологии экспериментальной валидации потенциальных мишеней довольно разнообразны - от экспериментов in vitro до моделей на животных.
1. Протеомные методы валидации потенциальных мишеней.
Протеомные методы незаменимы для предварительной валидации потенциальных мишеней, позволяющей исключить из списка явно «неправильные» мишени. Первоначально необходимо проверить, существует ли реально в целевом организме белок, выбранный в качестве потенциальной мишени чисто теоретически, на основе геномной информации. Для этой цели полностью подходит стандартная схема протеомного картирования белков микроорганизма: 1) получение биологического образца; 2) экстракция белков; 3) разделение белков (двумерный электрофорез или хроматография); 4) трипсинизация белков (частичный протеолиз белков под действием трипсина); 5) масс-спектрометрический анализ; 6) биоинформационная идентификация белков на основе сравнительного анализа экспериментальных и теоретических масс-спектров. В случае создания антимикробного средства с широким спектром действия необходимо проверить экспрессию целевого белка у всех микроорганизмов целевой группы.
В результате предварительной валидации белков-мишеней должны быть получены протеомные карты для различных штаммов целевых микроорганизмов. Если обнаружится вариабельность экспрессии белка, то такой белок может быть исключен из списка потенциальных мишеней по соображению возможного проявления лекарственной резистентности.
2. Геномные методы валидации потенциальных мишеней.
Последующая валидация мишеней, успешно прошедших проверку протеомными методами, может быть выполнена различными геномными методами, включающими такие процедуры как:
Инактивация целевого гена в результате мутаций;
Подавление транскрипции гена;
3. Разрушение целевой мРНК (использование рибозимов и малых интерферирующих РНК (siRNA);
4. Подавление трансляции (использование антисмысловых РНК и их аналогов);
5. Прямая инактивация целевого белка с помощью специфических антител конъюгированных с ингибиторами белков.
Большинство этих подходов основано на одной общей идее - проверить функциональную значимость потенциальной белковой мишени путем остановки ее экспрессии на одном из этапов «от гена до белка». Естественно, наиболее эффективны геномные методы блокирования экспрессии целевого белка в быстро растущих клетках. В тех случаях, когда потенциальная мишень существует длительное время и ее обновление происходит крайне медленно, более предпочтительны методы прямой инактивации белка.
3. Валидация потенциальных мишеней in vivo.
При рассмотрении методов по экспериментальной валидации мишеней нельзя не упомянуть о методах in vivo. Последние достижения в геномных исследованиях показали, что небольшие многоклеточные организмы (нематоды, дрозофила, рыбка-зебра и др.) содержат гены, близкие к тем, которые ответственны за возникновение болезней у человека. Поэтому в целях валидации мишеней для действия лекарств (при различных заболеваниях человека могут быть использованы разнообразные модели
in vivo - от беспозвоночных до «гуманизированных» мышей. К таким системам относятся, например, трансгенные мыши и мыши с нокаут-генами , рыбка-зебра (Danio rerio), нематоды, в том числе хорошо известная Caenorhabditis elegans, плодовая мушка дрозофила {Drosophila melanogaster), платформа VITA (Validation In vivo of Targets and Assays for antiinfectives) на мышах, паразитарные организмы.