Химерные белки

Очень часто, даже после успешного клонирования и подбора эффективных условий для экспрессии, чужеродные белки, особенно не­большие, обнаруживаются в клетках лишь в минимальных коли­чествах. Такой кажущийся низкий уровень экс­прессии кодирующих их генов во многих случа­ях объясняется быстрой деградацией этих чужеродных белков в хозяйских клетках. Один из способов решения этой проблемы состоит в ковалентном присое­динении продукта клонированного гена к како­му-нибудь стабильному белку клетки-хозяина. В составе подобной конструкции, получившей название «химерный белок», продукт клониро­ванного гена оказывается защищенным от рас­щепления протеазами хозяйской клетки, что было показано в ходе экспериментов.

Слияние белков программируется на уровне ДНК лигированием кодирующих участков соот­ветствующих генов.

Другим способом стабилизации белков является включение, генно-инженерными методами, в целевые белки нескольких дополнительных аминокислот в определенной последовательности (маркерные пептиды), которые обычно присоединяют к N-концу полипептидной цепи. Однако этот способ не всегда эффективен.

Перспективным является так же использование мутантных штаммов с искусственно вызванным дефицитом протеолитических ферментов.

И, наконец эффективным способом сохранения клонированных белков является стимулирование их эффективной секреции из клетки.

Расщепление химерных белков

В зависимости от предназначения белкового продукта клонированного гена он может исполь­зоваться как таковой или в составе химерного белка, причем последний вариант встречается нечасто. Это объясняется тем, что, из-за присутствия фрагмента хозяйского белка большинство химерных белков оказываются непригодными для применения в клинике в следствии высокой алергенности или низкой активности. Кроме то­го, для химерных белков предусмотрена более сложная процедура тестирования, которую они должны пройти, чтобы получить разрешение к применению у соответствующих организаций. Все это заставляет искать способы удаления лишних аминокислотных последовательностей из молекулы получаемого продукта.

Один из таких способов основан на присоединении бел­ка, кодируемого геном-мишенью, к белку клет­ки-хозяина через короткий полипептид, распознаваемый специфической протеазой не­бактериального происхождения. Такое присое­динение тоже программируется на уровне ДНК. Олигонуклеотидные линкеры, несущие сайты для протеаз, можно пришить к клонированному гену до того, как такая конструкция будет введе­на в экспрессирующую векторную систему сли­яния. Линкером может служить, например, олигонуклеотид, кодирующий пептид Ile-Glu-Gly-Arg. После синтеза, выделения и очистки химерного белка для отделения белкового продукта, коди­руемого клонированным геном можно исполь­зовать фактор свертывания крови Х_а, который является специфической протеазой, разрыва­ющей пептидные связи исключительно на С-конце последовательности Ile-Glu-Gly-Arg . Поскольку такой пептид встречается в природных белках довольно редко, этот подход можно использовать для отделения различных продуктов, кодируемых клонированными генами.

Белок хозяина-CONH-Ile-Glu-Gly-Arg-CONH-клонируемый белок

Химерные белки используются не только для стабилизации полипептидов, но и для упроще­ния процедуры очистки рекомбинантных белков. Так, плазмидная конструкция Saccharomyces cerevisiae, содержащая ген челове­ческого интерлейкина-2 с присоединенным к не­му сегментом ДНК, кодирующим маркер-ный пептид Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-, выполняет двоя­кую функцию: обеспечивает стабилизацию про­дукта гена интерлейкина-2 и облегчает его очист­ку. Интерлейкин-2 - это биологический фактор, стимулирующий рост Т-клеток и синтез В-кле­точных антител. Химерный белок, образующий­ся после экспрессии этой генетической конст­рукции в дрожжевых клетках, может быть очищен за один прием с помощью иммуноаффинной хроматографии. Для этого моно-клональные антитела к маркерному пептиду фиксируют на полипропиленовом носителе и пропускают через колонку химерный белок, который связы­вается с этими антителами. Маркерный пептид - небольшая молекула, на его образова­ние расходуется лишь малая часть клеточных ресурсов. Химерный белок обладает такой же биологической активностью, что и природный интерлейкин-2. Однако для применения в клинике маркерный пептид удаляют.