Получение рекомбинантных белков с помощью эукариотических систем

Прокариотические системы экспрессии успешно пользуются для синтеза многих белков. Однако некоторые белки для превращения в активную форму должны претерпеть специфические пострансляционные модификации - гликозилирование, фосфорилирование или ацетилирование, а бактерии к этому не способны. Поэтому было решено попытаться экспрессировать клонированные гены в эукариотических клетках с помощью специально созданных эукариоти-ческих экспрессирующих векторов.

Для синтеза разнообразных белков, кодируемых клонированными генами, использовались дрожжи S. cerevisiae. Их генетика хорошо изучена, а, кроме того, их можно выращивать в больших ферментерах и они считаются безопасными в обращении. Чтобы упростить очистку белков, были сконструированы векторы, обеспечивающие их секрецию. С помощью S. сегvisiae было получено множество самых разных белков аутентичных природным (вакцины против гепатита В, малярии, инсулин, факторы роста и свертывания крови). Однако многие рекомбинантные белки в этой системе не подвергались посттрансляционной модификации, к тому же с выход зачастую был недостаточно высок. Поэтому были предприняты попытки разработать другие дрожжевые системы синтеза рекомбинантных белков.

В поисках других эукариотических систем экспрессии, с помощью которых можно было бы получать биологически активные белки, исследователи сосредоточили усилия на создании экспрессирующих векторов на основе бакуловирусов, в частности бакуловируса AcMNPV, инфицирующего клетки многих насекомых. Клетки насекомого, инфицированные рекомбинантным бакуловирусом, синтезировали клонируемый белок.

Внехромосомные экспрессирующие векторы млекопитающих (например, на основе обезьяньего вируса SV40) используются для изучения функций и регуляций генов млекопитающих. Кроме того, с их помощью могут быть получены аутентичные рекомбинантные белки, которые могут использоваться в медицинских целях. Однако промышленный синтез с использованием модифицированных клеток млекопитающих обходится слишком дорого и может применяться только для получения рекомбинантных белков, которые невозможно получить другим путем. Примером может служить производство рекомбинантного эритропоэтина. Эритропоэтин – белок гликопротеид в организме человека регулирует процессы созревания (дифференцировки) эритроцитов. Препараты на основе эритропоэтина используют для лечения рака, болезней крови, почек, для повышения выносливости человека к физическим нагрузкам (допинг-препараты). Поскольку бактериальные клетки не способны к гликозилированию белков человека, ген эритропоэтина встраивают в яйцеклетки китайского хомячка, которые далее культивируют поверхностным способом в виде монослоя клеток. Такая сложная технология получения обусловливает высокую стоимость препаратов на основе генноинженерного эритропоэтина.

Лекция № 12 Получение лекарственных препаратов белковой природы на основе методов генной инженерии

1.Получение инсулина.

Инсулин - гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень саха­ра в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит к одному из тяжелейших заболеваний - сахарному диабету, кото­рый как причина смерти стоит на третьем месте после сердечно­сосудистых заболеваний и рака. Инсулин - небольшой глобуляр­ный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоя­щий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками. Синтезируется он в виде одноцепочечного предшественника - препроинсулина, содержащего кон­цевой сигнальный пептид (23 аминокислотных остатка) и 35-звенный соединительный пептид (С-пептид). При удалении сигналь­ного пептида в клетке образуется проинсулин из 86 аминокислот­ных остатков, в котором А и В-цепи инсулина соединены С-пептидом, обеспечивающим им необходимую пространственную ориентацию при за­мыкании дисульфидных связей. После протеолитического отщеп­ления С-пептида образуется инсулин.

Со времени открытия инсулина в 1921 году Бантингом и Бестом, которые выделили гормон из поджелудочной железы новорожденного теленка и показали снижение уровня глюкозы в сыворотке крови экспериментального животного после введения препарата, прошло больше 80 лет. За это время была создана индустрия производства инсулина.

Обычно поджелудочная железа крупного рогатого скота и свиней не используется в мясной и консервной промышленности и постав­ляется в вагонах-рефрижераторах на фармацевтические предприя­тия, где проводят экстракцию гормона. Для получения 100 г крис­таллического инсулина необходимо 800 -1000 кг исходного сырья. Однако такой инсулин отличается по строению (аминокислотной последовательности) от инсулина человека и его использование напрямую малоэффективно. Например свиной инсулин отличается от человеческого на одну аминокислоту у С-конца В-цепи (аланин вместо треонина- на) Поэтому предварительно проводят химическую модификацию животного инсулина с целью придания ему структуры человеческого инсулина. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствуещего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека.

Развитие с середины 1970-х годов технологии получения рекомбинантных ДНК значительно изменило характер исследований, проводимых в области генетики, молекулярной биологии и биотехнологии. Разработка методов изменения генетического аппарата клеток, позволяющих вводить в них чужеродные гены, клонировать их, экспрессировать и получать биосинтетические белки в необходимом количестве обеспечила возможность создания новой отрасли фармацевтической промышленности и обеспечения здравоохранения различными белковыми препаратами (инсулином, эритропоэтином, интерферонами и др.)

Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 20 лет назад. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клет­ках Е. coli . Каждый из полученных синтетических генов последовательно подстраивался к 3 '-концу гена фермента (β-галактозидазы и вводил­ся в векторную плазмиду (pBR322). Клетки Е. coli, трансформиро­ванные такими рекомбинантными плазмидами, производили гиб­ридные (химерные, рекомбинантные) белки, состоящие из фрагмента β-галактозидазы, соединенной через остаток метионина с А и В цепями инсулина. При обработке in vitro химерного белка бромцианом пептид А-В высвобождался и далее ферментативно расщеплялся на фрагменты А и В. Однако замыкание дисульфидных мостиков между несвязанными С-пептидом А и В-звеньями инсулина происходило с трудом и данный метод получения инсулина не получил своего развития .

Поэтому в дальнейшем был разработан метод получения проинсулина человека целиком, с последующей его трансформацией в инсулин in vitro. Для этого искусственно была синтезирована нуклеотидная последовательность кодирующая структуру проинсулина, которая затем была встроена в плазмиду к 3 '-концу гена β-галактозидазы. Трансформированные такими плазмидами клетки Е. coli синтезировали химерный белок, состоящий из фрагментов проинсулина и β-галактозидазы, который далее in vitro последовательно превращали в инсулин человека (рис.1.).